序列对齐/映射格式规范

1 SAM 格式规范

 1.1 示例

@HD VN:1.6 SO:coordinate
@SQ SN:ref LN:45
r001 99 ref 7 30 8M2I4M1D3M = 37 39 TTAGATAAAGGATACTG *
r002 0 ref 9 30 3S6M1P1I4M * 0 0 AAAAGATAAGGATA *
r003 0 ref 9 30 5S6M * 0 0 GCCTAAGCTAA * SA:Z:ref,29,-,6H5M,17,0;
r004 0 ref 16 30 6M14N5M * 0 0 ATAGCTTCAGC *
r003 2064 ref 29 17 6H5M * 0 0 TAGGC * SA:Z:ref,9,+,5S6M,30,1;
r001 147 ref 37 30 9M = 7 -39 CAGCGGCAT * NM:i:1

1.2 术语和概念

1.2.1 字符集限制

 1.3 页眉部分

1.3.1 已定义的子排序术语

1.3.2 MD5 计算参考

• 
  除 33 ('!') 至 范围之外的所有字符都会被删除。这将删除所有不可打印字符和空白字符，包括空格和新行。其他所有字符都会保留，即使不是合法的核苷酸代码。
• 
  所有小写字母都会转换为大写字母。这一操作等同于对 POSIX 本地语言中的字符调用 toupper()。
• 
  MD5 摘要的计算方法如 RFC 1321 所述，并以 32 个字符的小写十六进制数表示。

1.4 对齐部分：必填字段

1. 
   QNAME：查询模板名称。具有相同 QNAME 的读数/段被视为来自同一模板。QNAME '*' 表示信息不可用。在 SAM 文件中，当一个读数的排列是嵌合的或给出了多个映射时，它可能会占用多个排列行。
2. 
   FLAG：按位排列的 FLAG 组合。 下表解释了每个位：

• 
  对于 SAM 文件中的每个读取/连续文件，都要求与读取相关的一行且仅有一行满足 "FLAG & '。这一行被称为读取的主要行。
• 
  比特 0x100 标志着在某些分析中，当使用的工具意识到该比特时，将不使用对齐方式。当 SAM 中出现多个映射时，它通常用于标记替代映射。
• 
  位 表示相应的对齐行是嵌合对齐的一部分。标记为 0x800 的行称为补充行。
• 
  位 是判断读取是否未映射的唯一可靠依据。如果设置了 ，就不能对 RNAME、POS、CIGAR、MAPQ 以及位 和 做出任何假设。
• 
  位 0x10 表示 SEQ 是否已反向补码和 QUAL 反转。当第 0 x 4 位未设置时，这对应于测序段所映射的链路：第 0 x 10 位未设置表示正向链路，设置表示反向链路。当 0 x 4 位被设置时，表示未映射读数是否以从测序机上下来时的原始方向存储。
• 
  位 和 反映了所用测序技术中每个模板内固有的读数排序。 如果 和 都被设置，则读数是线性模板的一部分，但既不是第一个读数，也不是最后一个读数。如果 和 都未设置，则读数在模板中的索引未知。这种情况可能发生在非线性模板中，或者在数据处理过程中丢失了这一信息。
• 
  如果未设置 ，则无法对 和 进行假设。
• 
  表中未列出的位保留供将来使用。当前软件在写入时不应设置这些位，在读取时也应忽略它们。

3. 
   RNAME：比对的参考序列名称。如果存在 @SQ 标题行，RNAME（如果不是 ）必须出现在其中一个 SQ-SN 标记中。无坐标的未映射段有一个 ，在

• 
  "消耗查询 "和 "消耗参考 "分别表示 CIGAR 操作是否会导致比对沿着查询序列和参考序列进行。
• 
  H 只能作为第一个和/或最后一个操作出现。
• 
  S 与 CIGAR 字符串两端之间只能进行 H 运算。
• 
  对于 mRNA 到基因组的比对，N 运算代表内含子。对于其他类型的比对，N 的解释没有定义。
• 
  操作的长度总和应等于 SEQ 的长度。

7. 
   RNEXT：模板中下一个读数的主排列参考序列名称。对于最后一个读数，下一个读数是模板中的第一个读数。如果存在 @SQ 标头行，RNEXT（如果不是 或 ' '）必须出现在其中一个 SQ-SN 标记中。当信息不可用时，该字段将被设置为 "*"；如果 RNEXT 与 RNAME 相同，该字段将被设置为" "。如果不是' '，且模板中的下一次读取有一个主映射（另见 FLAG 中的位 ），则该字段与下一次读取的主行 RNAME 相同。如果 RNEXT 为 ，则不能对 PNEXT 和位 进行假设。
8. 
   PNEXT：1-based 下一读数在模板中的主排列位置。当信息不可用时设置为 0。该字段等于下一个读数主排列行的 POS。如果 PNEXT 为 0，则不能假设 RNEXT 和位 。
9. 
   TLEN：带符号的观察模板长度（Template LENgth）。对于模板中所有读数的主排列都映射到同一参考序列的主读数，TLEN 的绝对值等于模板的映射末端与模板的映射起点之间的距离（即末端-起点+1）。 注意，映射碱基的定义是与 CIGAR 所描述的参考文献对齐的碱基，因此不包括软缺口碱基。TLEN 字段对于模板最左边的片段是正值，对于最右边的片段是负值，中间片段的符号未定义。如果片段覆盖相同的坐标，则可以任意选择最左和最右的片段，但两端必须有不同的符号。如果是单段模板或当

1.5 对齐部分：可选字段

2 SAM 格式的建议做法

1.  页眉部分
   
   1 应该有 @HD 行，并指定 SO 标记或 GO 标记（但不能同时指定）。
   
   2 如果已对读数进行了映射，则应出现 @SQ 行。
   
   3 当 RG 标记出现在对齐部分的任何位置时，页眉中应出现一个与 ID 标记匹配的 @RG 行。
   
   4 当 PG 标记出现在对齐部分的任何位置时，页眉中应出现一个与 ID 标记匹配的 @PG 行。
2. 
   相邻的 CIGAR 行动应有所不同。
3. 
   不应将任何排列分配给制图质量为 255 的排列。
4.  未映射读数
   
   1 对于伴侣已被映射的未映射成对末端或伴侣对读数，未映射读数的 RNAME 和 POS 应与其伴侣相同。
   
   2 如果模板中的所有线段都未映射，则其 RNAME 应设置为'*'，POS 应设置为 0。
   
   3 如果 POS 加上 CIGAR 中 操作的长度总和超过 @SQ 头行（如果存在）LN 字段中指定的长度（SN 等于 RNAME），除非参考序列是环状的（见下文），否则应取消对齐。
   
   4 未映射读数应以它们从测序机上下来时的方向存储，并相应地取消反向标志位（ ）的设置。
5.  多重映射
   
   1 当一个数据段出现在多行中以表示该数据段的多重映射时，只有其中一条记录的辅助对齐标志位 ( ) 未被设置。RNEXT 和 PNEXT 指向模板中下一次读取的主行。
   
   2 SEQ 和次级排列的 QUAL 应设置为 ' 以减小文件大小。
6.  可选标签：
   
   1 如果模板有 2 个以上分段，则应出现 TC 标记。
   
   2 应该有 NM 标签。
7. 
   循环参考序列

3 SAM 中的装配序列描述指南

3.1 无衬垫表示法与有衬垫表示法

 3.2 填充式 SAM

@HD VN:1.6 SO:coordinate
@SQ SN:ref LN:47
ref 516 ref 1 0 14M2D31M * 0 0 AGCATGTTAGATAAGATAGCTGTGCTAGTAGGCAGTCAGCGCCAT *
r001 99 ref 7 30 14M1D3M = 39 41 TTAGATAAAGGATACTG *
* 768 ref 8 30 1M * 0 0 * * CT:Z:.;Warning;Note=Ref wrong?
r002 0 ref 9 30 3S6M1D5M * 0 0 AAAAGATAAGGATA * PT:Z:1;4;+; homopolymer
r003 0 ref 9 30 5H6M * 0 0 AGCTAA * NM:i:1
r004 0 ref 18 30 6M14N5M * * 0 0 0 ATAGCTTCAGC \
r001 147 ref 39 30 9M = 7 -41 CAGCGGCAT * NM:i:1

4 BAM 格式规范

4.1 BGZF 压缩格式

1. 
   标头中的 F.EXTRA 位被设置，表示存在额外字段。
2. 
   BGZF 使用的额外字段使用两个子字段 ID 值 66 和 67（ASCII "BC"）。
3. 
   BGZF 额外字段有效载荷（gzip 规范中的字段 LEN）的长度为 2（两个字节的有效载荷）。
4. 
   BGZF 额外字段的有效载荷是一个 16 位无符号整数，采用 little endian 格式。该整数表示包含的 BGZF 块的大小减一。