应用遗传学和分子生物技术

高效的长片段编辑技术，实现大规模、无疤痕的细菌基因组工程

黄朝勇

& 郭丽伟

& 王晶歌

& 王宁

& Yi-Xin Huo

收稿日期： 2020-03-26 / 修回日期： 2020-07-20 / 录用日期： 2020-08-08 # Springer-Verlag GmbH Germany，Springer Nature 2020 的一部分

抽象

细菌是多才多艺的生命系统，可以增强我们对自然的理解，并能够生物合成有价值的化学物质。长片段编辑技术对于加速细菌基因组工程以获得理想的遗传稳定菌株非常重要。然而，现有的基因组编辑方法无法满足工程师的需求。本文报道了一种用于大肠杆菌大规模无疤痕基因组工程的高效长片段编辑方法。该方法使我们能够将高达12 kb的DNA片段插入基因组，并从基因组中删除高达186.7 kb的DNA片段，阳性率超过95%。我们将这种方法应用于大肠杆菌基因组简化，产生了12个个体缺失突变体和4个累积缺失突变体。最简单的基因组总共丢失了 370.6 kb 的 DNA 序列，其中包含 364 个开放阅读框。此外，我们将该技术应用于代谢工程，并获得了遗传稳定的质粒非依赖性异丁醇生产菌株，该菌株通过摇瓶发酵产生 1.3 g/L 异丁醇。这些结果表明，该方法是一种强大的基因组工程工具，突出了其在合成生物学和代谢工程中的应用潜力。

要点

本文报道了一种有效的大肠杆菌基因组工程工具。

该工具有利于长DNA片段的操作。

该工具已成功应用于基因组简化。

该工具已成功应用于代谢工程。

关键词 Genome engineering .长片段编辑。遗传稳定性。基因组简化 。代谢工程

介绍

作为一类多功能的生命系统，细菌在合成生物学的许多领域都很有用。在细菌中

单拷贝基因组中包含的遗传信息决定了特定菌株的特征。为了了解细菌的特征并利用它们来探索世界和为人类生活服务，研究人员经常进行基因组工程以重新编程细菌的遗传信息。通过DNA编辑，研究人员可以在细菌基因组中添加所需的外源性遗传信息或删除不需要的内源性遗传信息。长片段编辑技术对于加速细菌基因组工程以获得遗传稳定的菌株具有重要意义。例如，长片段删除技术可以帮助简化细菌基因组以探索特定菌株的最小基因组（Kato and Hashimoto 2007， 2008），而长片段插入技术可以帮助扩展细菌基因组以存档人类世界的扩展信息（Shipman et al. 2017）。在代谢工程中，质粒维持需要持续使用抗生素，这导致了生物安全问题和工业成本增加（Mignon 等人，2015 年）。长片段编辑技术是

黄朝勇和郭丽伟对这项工作做出了同样的贡献。

电子补充材料 本文（https://doi.org/10.1007/s00253-020-10819-1）的在线版本包含补充材料，可供授权用户使用。

* 霍奕欣

huoyixin@bit.edu.cn

北京理工大学生命科学学院分子医学与生物治疗重点实验室， 北京100081

SIP-UCLA技术发展研究院，中国苏州215123

应用微生物学和生物技术 https://doi.org/10.1007/s00253-020-10819-1

构建不依赖质粒和高产量菌株的理想工具。

为了加速基因组工程的进程，研究人员开发了许多在细菌基因组中产生插入和缺失的方法。重组是一种经典方法，在合成社区中已经流行了 20 年（Datsenko 和 Wanner 2000;Sharan 等人，2009 年;Jeong 等人，2013 年;Pines 等人，2015 年）。虽然重组可以处理短DNA片段的插入和删除（Wang等人，2009;Warner 等人，2010 年;Isaacs 等人，2011 年），长片段的编辑效率急剧下降（Jeong 等人，2013 年）。一方面，线性供体DNA的转化效率随长度的延长而急剧下降;另一方面，重组依赖于复制叉的形成，并且用于供体DNA退火的复制叉的范围是有限的（Mosberg等人，2010）。在靶DNA中产生双链断裂（DSB）是提高基因组编辑效率的有效策略，因为DSB完全刺激DNA修复途径。对于切割双链 DNA （dsDNA），CRISPR/Cas9 比归巢核酸内切酶 I-SceI 灵活得多，后者在诱导 DNA 切割之前需要将 18 bp 识别位点整合到靶 DNA 中（Tischer 等人，2006 年;Yu 等人，2008 年;Yang 等人，2014 年）。Cas9核酸内切酶与设计的单向导RNA（sgRNA）复合可以在特定的原间隔序列中产生DSB，其中存在适当的原间隔区相邻基序（PAM）（Gasiunas等人，2012;Jinek 等人，2012 年;江等人，2013）。CRISPR/Cas9 技术依赖于靶位点的 sgRNA 定向切割来杀死野生型细胞，从而避免了对可选标记或反选择系统的需求。 此外，改变 20-bp 间隔序列可以重新编程 Cas9-sgRNA 复合物的特异性。在过去的 7 年中，已经报道了许多基于 CRISPR/Cas9 技术的基因组编辑方法和协议（Garst 等人，2017 年）。这些方法省时且易于使用，但它们仍然不能从根本上解决长片段编辑的问题。在许多方法中，CRISPR/Cas9系统仅作为一种选择工具，其潜力尚未得到充分利用（Li等人，2019a;Wu 等人，2019 年）。CRISPR / Cas9辅助的非同源末端连接（NHEJ）很好地利用了潜力，并且可用于长片段缺失（Su等人，2016,2019;Zheng 等人，2017 年;Huang 等人，2019 年）。然而，它不可避免地会产生随机插入缺失，并可能导致DNA重排。此外，这种策略不可能插入长片段。

在所有基于CRISPR/Cas9的基因组编辑方法中，CRISPR/Cas9辅助重组方法表现更好。现有的CRISPR / Cas9辅助重组方法使用环状DNA（质粒携带的dsDNA）（江等人，2015;Zhao 等人，2016 年;Feng et al. 2018） 或线性 DNA（PCR扩增的 dsDNA 或合成的 ssDNA） （江 et al. 2013， 2015;Li 等人，2015 年;Zhang 等人，2017 年;Zhao et al. 2017）作为编辑模板

这两种模板都有优点和缺点。环状编辑模板可以避免DNA核酸外切酶的攻击，并随着质粒复制而自我复制，从而产生更高的同源重组效率和编辑效率。然而，总质粒很有可能被整合到基因组中，并且这些重组事件很难通过常规PCR验证与所需的重组事件区分开来，导致假阳性率很高。似乎这种现象还没有被注意到。线性编辑模板避免了质粒整合带来的麻烦，从而产生了更高的阳性率。然而，线性编辑模板对DNA核酸外切酶的敏感性导致较低的同源重组效率和编辑效率。为了解决这一矛盾，我们在现有CRISPR/Cas9辅助重组方法的基础上进行了系统优化，开发了一种高效的长片段编辑方法，用于大肠杆菌大规模、无疤痕的基因组工程。这种方法使我们能够在基因组中插入和删除大的DNA片段，具有很高的阳性率和编辑效率。值得注意的是，该方法的高性能与高转化效率无关，使该方法更容易付诸实践。此外，该方法还成功应用于基因组简化和代谢工程，证明了其作为构建遗传稳定的大肠杆菌菌株的基因组工程工具的价值。我们认为，除大肠杆菌外，该方法还具有广泛应用于其他测序生物的潜力。

材料与方法

菌株和培养条件

大肠杆菌菌株DH5α（American Type Culture Collection，ATCC 68233）作为分子克隆和质粒操作的宿主菌株。MG1655 （ATCC 47076） 在编辑实验中用作遗传物质，除非另有说明。本研究中涉及的菌株列于表S1中。基因组编辑实验中使用的验证引物列于表S2中。除另有说明外，所有情况下均使用 Luria-Bertani （LB） 培养基（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物和 10 g/L NaCl）进行细胞生长。固体培养基含有 20 g/L 琼脂。使用含有分解代谢物抑制 （SOC） 培养基（20 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、0.5 g/L NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl、10 mM MgSO 和 20 mM 葡萄糖）的超最佳肉汤进行细胞回收。采用M9培养基（6 g/L NaHPO、3 g/L KHPO、0.5 g/L NaCl、1 g/L NHCl、1 mM MgSO、0.1 mM CaCl、10 mg/L VB、40 g/L葡萄糖和4 g/L酵母提取物）进行摇瓶发酵。氨苄西林（Amp）和卡那霉素（Kan）的工作浓度分别为0.1 g/L和0.025 g/L。工作浓度

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培养基或培养物中的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）、X-半乳糖、葡萄糖和蔗糖分别为 1 mM、0.1 g/L、10 g/L 和 20 g/L。拉腊糖在液体培养基中的工作浓度为20 mM，在固体培养基中的工作浓度为5 mM。本研究中使用的试剂和培养基的详细信息列于表S3中。

质粒构建

本研究中涉及的质粒列于表S4中。质粒p15A-P-Cas9-P Redγβα、pSC101-P-sgRNA-Donor-T1、pSC101-PsgRNA-Donor-T2和pSC101-P-sgRNA-Donor-T3的完整序列见注S1-S4。本研究中设计的CRISPR靶序列列于表S5中。质粒pSC101-P-sgRNA-Donor的构建是基因组编辑实验的关键步骤。当构建含有一个sgRNA表达嵌合体的pSC101P-sgRNA-供体质粒时，pSC101-P-sgRNA-Donor-T1作为亲本质粒。首先，将专门设计的供体DNA整合到pSC101-P-sgRNA-Donor-T1中以构建中间质粒。供体 DNA 包含两个约 500 bp 的同源臂。然后，通过单个PCR和单个Gibson组装将特定的间隔物（20bp）插入araB启动子和gRNA支架之间的中间质粒中（Gibson等人，2009）。PCR引入的间隔区在Gibson Assembly中起到了重叠的作用。当构建含有两个sgRNA表达嵌合体的pSC101-P-sgRNA-供体质粒时，pSC101-P-sgRNADonor-T2和pSC101-P-sgRNA-Donor-T3作为亲本质粒。首先，将专门设计的供体DNA整合到pSC101-P-sgRNA-Donor-T2中，以构建中间质粒。然后，将中间质粒与pSC101-P-sgRNA-Donor-T3结合，通过PCR和Gibson组装构建pSC101-P-sgRNA-Donor质粒。PCR引入的两个特定间隔区在Gibson Assembly中作为重叠。pSC101-P-sgRNA-供体质粒的详细构建过程如图S1所示。为了减少构建过程，质粒pSC101-P-sgRNA-Donor也可以通过多个片段的单个Gibson组装获得。

基因组编辑、质粒固化和迭代编辑程序

首先，将抗Kan（Kan）质粒p15A-P-Cas9P-Redγβα（质粒#1）转化到MG1655等靶株中，得到相应的转化体MG1655/质粒#1。构建了一系列温敏Amp抗性（Amp）质粒，表达特异性sgRNA并生成特异性供体DNA，这些质粒统称为pSC101-P-sgRNA-Donor（质粒#2）。然后

将特异性质粒#2转化成MG1655/质粒#1菌株，在30°C下用Amp、Kan和葡萄糖在LB板中筛选MG1655/质粒#1/质粒#2菌株。 将一个或几个单菌落接种到2mL LB培养基中，并在30°C下培养2小时（时间1）。然后，将 2 μL Amp、2 μL Kan 和 20 μL IPTG 加入培养物中。1小时（时间2）后，加入20μL拉维诺糖，并在铺板前再培养培养物3小时（时间3）。将培养物的 1 μL 或 0.1 μL 等分试样接种到含有 Amp、Kan 和 L-阿拉伯糖的 LB 平板上，并将该板在 30 °C 下孵育过夜。 阳性突变体通过菌落PCR和测序进行验证。基因组编辑的流程图如图1和图S2所示。将阳性突变体在LB培养基中仅Kan在40°C下培养12小时，以除去温度敏感的Amp质粒#2（图S3a）。然后，将获得的仅含有质粒#1的编辑菌株作为下一轮基因组编辑的起始菌株。在没有 Kan 的情况下，Kanplasmid#1 在宿主菌株中不稳定。当最后一轮基因组编辑完成时，将编辑的菌株在40°C的LB无抗生素培养基中培养12小时，以去除Ampplasmid#2和蔗糖敏感的Kanplasmid#1（图S3b）。将过夜培养物稀释以在含有蔗糖的LB板上接种。从理论上讲，在平板上生长的菌落是无质粒的。为了进一步验证，将单个菌落接种到有或没有相应抗生素的LB培养基中。质粒固化和迭代编辑的流程图如图S2所示。

正率和编辑效率的计算

通过菌落PCR检测含有Amp、Kan和L-阿拉伯糖的LB板中的100个菌落，以筛选阳性突变体。通过测序进一步验证了20个阳性突变体。阳性率计算为阳性菌落占菌落总数的比例。在蓝白选择实验中，阳性菌落也通过其颜色被识别。白色菌落为阳性，蓝色菌落为阴性。将一个对照组与实验组一起设置，以计算编辑效率。对照组未加入L-阿拉伯糖，因此未表达Cas9蛋白和sgRNA。所有其他条件和过程与实验组相同。编辑效率计算为实验组阳性菌落占对照组菌落总数的比例。

生长曲线和转化效率的测量

为了测量生长曲线，将一个菌落接种到 5 mL LB 培养基中，并培养培养

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在37°C下12小时。然后，将 1 mL 种子液接种到 100 mL 新鲜 LB 培养基中，并在 37 °C 下在 220 rpm 振荡器中培养培养物。在 12 小时的培养过程中，每小时取样一次，使用紫外分光光度计（V-5100，上海美泰仪器有限公司）测量 600 nm 波长 （OD600） 的培养物光密度。为了测量转化效率，使用纯pUC19作为超螺旋DNA。首先，将 1 μL pUC19 （1 ng/μL） 加入一管感受态细胞 （100 μL） 中。接下来，将混合物孵育30分钟，然后在42°C水浴中进行热休克1分钟。然后，将试管置于冰上2分钟，然后加入900μL 37°C SOC培养基，并将试管以200–230rpm（37°C）摇动40分钟。最后，将 100 μL 培养物接种在含有 Amp 的 LB 平板上，并将该平板在 37 °C 下孵育过夜

转化效率为N×10 CFU/μg pUC19（“N”是指在板中获得的转化体数量）。

摇瓶发酵和产品检测

为了测试异丁醇的生产，将工程菌株的单个菌落接种到含有适当抗生素的5 mL LB培养基中，并将培养物在37°C下培养12小时。然后，将 200 μL 种子液转移到含有 20 mL 无抗生素 M9 培养基的密封摇瓶中进行微需氧发酵。在72小时发酵期间，每12小时取样一次，以测试异丁醇的生物量和滴度。用紫外分光光度计（V-5100，上海美泰仪器有限公司）测量发酵液OD600，对生物质进行评价。为了测量异丁醇浓度，

图1 基因组编辑系统的构成和基因组编辑示意图。LHA左同源臂，RH：右同源臂

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