自然风光 |第 610 卷 |13 年 10月 2022 日 |327
品
产前免疫应激使小胶质细胞反应迟钝，损害神经回路
Lindsay N. Hayes， Kyongman An， Elisa Carloni， Fangze Li， Elizabeth Vincent， Chloë Trippaers， Manish Paranjpe， Gül Dölen， Loyal A. Goff， Adriana Ramos， Shin-ichi Kano& Akira Sawa✉
最近的研究表明，小胶质细胞是主要的脑免疫细胞，可以影响回路连接和神经元功能。小胶质细胞在胚胎发育的早期浸润神经上皮细胞，并在整个成年期维持在大脑中。一些母体环境因素（如微生物组异常、免疫激活和营养不良）会影响产前大脑发育。然而，尚不清楚产前环境的变化如何指导浸润小胶质细胞的发育轨迹，进而影响大脑发育和功能。在这里，我们表明，在小鼠体内母体免疫激活 （MIA） 后，来自后代的小胶质细胞在整个发育轨迹中的免疫反应性（迟钝）长期降低。免疫反应减弱伴随着染色质可及性的变化和开放染色质的转录因子占有率降低。单细胞 RNA 测序分析显示，MIA 不会诱导不同的亚群，而是会降低对炎性小胶质细胞状态的贡献。用幼稚小胶质细胞的生理浸润对 MIA 后代的小胶质细胞进行产前置换，改善了免疫减弱，并恢复了突触前囊泡释放到多巴胺受体 2 型中棘神经元上的概率降低，表明由于不利的产前环境而异常形成的小胶质细胞影响了小胶质细胞的长期反应性和适当的纹状体回路发育。
小胶质细胞是原代的脑免疫细胞，在整个生命周期中具有许多功能。它们的主要功能是快速免疫激活以保护大脑，但小胶质细胞免疫激活功能障碍会导致周围神经元和神经胶质细胞的不良结果。由于小胶质细胞是早期进入大脑的长寿细胞，因此在早期发育到达的异常小胶质细胞可能在调节这些细胞间相互作用方面发挥关键作用，贯穿健康和疾病的轨迹。几项研究表明，产前压力对以后的大脑发育和功能有影响。然而，小胶质细胞在产前应激引起的长期变化中的作用和机制尚不清楚。
成年 MIA 后代的小胶质细胞反应性变钝
为了解决这一知识差距，我们测试了产前免疫应激源 （MIA） 是否影响小胶质细胞功能，包括免疫激活。为了产生 MIA 后代，我们在胚胎第 9.5 天 （E9.5） 向怀孕的母体递送免疫激活剂（聚肌苷酸：聚胞苷酸 （PIC）），以靶向浸润神经上皮的第一波小胶质细胞。研究 MIA 如何影响后代免疫反应
我们在体内向成年后代注射促炎刺激物 （脂多糖 （LPS） ） 或盐水 （SAL），分离小胶质细胞并分析基因表达谱（扩展数据图 1）。首先，我们比较了 MIA 后代 （MIA 小胶质细胞） 和对照后代 （CON 小胶质细胞） 的小胶质细胞之间的基因表达。SAL 处理后，我们仅观察到 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的 7 个差异表达基因 （DEG）（图 1a 和扩展数据图 2）。相比之下，我们在 LPS 处理后在 MIA 和 CON 小胶质细胞之间鉴定了 401 个 DEGs（图 1a 和扩展数据图 2）。有趣的是，与 CON 小胶质细胞相比，大多数 DEGs （76%） 在 MIA 中下调（图 1a）。此外，DEGs 对许多免疫反应通路显示出显著的负富集（图 1b）。总之，MIA 小胶质细胞的成体免疫反应性显著降低，尽管 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的基线 （SAL） 基因表达相似。
为了直接解决 MIA 小胶质细胞免疫反应性降低的问题，我们比较了 LPS 和 SAL 治疗之间的小胶质细胞基因表达 （LPS 反应基因）。在 CON 小胶质细胞中，LPS 和 SAL 治疗之间有 5,624 个基因差异表达，而在 MIA 小胶质细胞中，LPS 和 SAL 治疗之间差异表达的基因较少 （4,284） （图 1c 和扩展数据图 2）。
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05274-z
收稿日期： 2019-05-08
录用日期： 2022-08-24
在线发布：2022 年 9 月 28 日
检查更新
1Solomon H. Snyder 美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系。约翰霍普金斯大学医学院精神病学和行为科学系，美国马里兰州巴尔的摩。美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院 McKusick-Nathans 遗传医学研究所。哈塞尔特大学生物医学研究所，哈塞尔特，比利时。美国阿拉巴马大学伯明翰分校 Heersink 医学院精神病学和行为神经生物学系。美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院生物医学工程。美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学。约翰霍普金斯大学医学院彭博公共卫生学院心理健康，美国马里兰州巴尔的摩。✉电子邮件： asawa1@jh.edu
328 元 |自然风光 |第 610 卷 |13 十月 2022
品
1
2
3
6
4
7
8
9
5
10
11
a
d
病毒反应
蛋白
地方化
RNA 加工
染色体
增殖
译本
蛋白
MIS/折叠
免疫的
线粒体
细胞凋亡
金属装订
RNA 加工
其他
泛素
转录
代谢：脂肪酸
氧化还原/ OxPhos
呼吸 TCA
Blunted
Enhanced
Pathway analysis (SAL/LPS)
in CON and MIA
q-value ratio
e
f
g
i
h
c
CON
MIA
2,267
927
3,357
b
免疫的
对病毒的防御反应 对 I 型干扰素的反应 模式识别受体信号通路的正调节 IFNγ 介导的信号通路 先天免疫反应的负调节
细胞质翻译 核转录 mRNA 分解代谢过程 翻译起始 病毒基因表达
核转录的 mRNA 分解代谢过程 无义介导的衰变 建立蛋白质定位到膜 蛋白质靶向到膜 共翻译蛋白靶向到膜 蛋白质定位到内质网 蛋白质定位到内质网的建立
ER核糖体的结构成分
基因调控
Memb
*
0
5
10
15
SAL LPS
血清 IL-6 （log
2
， AU）
j
康米亚
1
10
100
Ccl3
表达
集群 2
0
5
10
15
20
到 soma 的距离
交叉路口数
背肌
到 soma 的距离
腹侧 Str
0
10 20 30 40 50 0
10 20 30 40 50
CON:SAL
CON:LPS
MIA:SAL
MIA:LPS
k
1
10
100
1,000
Ccl12
表达
集群 5
CON
MIA
1
10
100
Cxcl10
表达
集群 11
康米亚
20
25
30
35
40
0
5
10
15
20
0
1
2
3
4
5
簇
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
P = 0.04
P = 0.1
P = 0.08
每个样品的细胞数 （%）
每个样品的细胞数 （%）
每个样品的细胞数 （%）
−10
−5
0
5
10
−10
−5
10
0
5
FC （log） CON
FC （对数
2
） MIA
斜率 = 0.71
CCC = 0.81
−10
−5
0
5
10
−10
−5
10
美亚
Both
0 5
FC （log） CON
FC （对数
2
） MIA
2,260
916
1,050
1,946
CON
MIA
SAL LPS
SAL LPS
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
背肌
小胶质细胞中的 CD68 （%）
腹侧 Str
*
*
*
群
CON
MIA
Trt
SAL
LPS
NS
*
地区
群
CON
MIA
D Str
V Str
× 组 Trt
Trt
SAL LPS NS
NS
NS
401
SAL
LPS
5
96
305
2
*
地区
群
CON
MIA
D Str
V Str
× 组 Trt
Trt
SAL
LPS
NS
*
*
核酸外切酶活性 对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有活性 脱氧核糖核苷酸代谢过程 催化活性作用于 RNA 核酸外切酶活性
图 1 |MIA 后小胶质细胞免疫反应减弱。a， DEGs （q < 0.05）
急性 SAL 或 LPS 治疗后 MIA 和 CON 小胶质细胞之间。b， 急性 LPS 治疗后 MIA 和 CON 小胶质细胞之间 a 中 DEGs 富集量排名前 20 的基因集。显示了 MIA 小胶质细胞的减少（蓝色）和 MIA 小胶质细胞（橙色）的增强。ER，内质网;memb，膜。c， 与 MIA 小胶质细胞相比，CON 小胶质细胞中 SAL 和 LPS 之间的 DEGs （q < 0.05）。d，e，倍数变化的图 （d） 和线性回归 （e） （FC;LPS/SAL） 用于 CON 和 MIA（粉红色）、仅 CON （黑色）或仅 MIA（红色）小胶质细胞中 LPS 诱导的 DEGs。这些数字显示每个部分中 LPS 响应的 DEG。蓝线显示线性拟合（斜率 = 0.71，CCC = 0.81）。f， CON 和 MIA 小胶质细胞之间 LPS 反应基因的预排序基因集富集分析的比较。圆圈是基因本体论 （GO） 术语，颜色表示 q 值比率 （q < 0.05） 的大小。选择对数转换 q 值比值为 ≥1 的项。显示了 MIA 小胶质细胞中钝化的 LPS 反应（蓝色）和增强的 LPS 反应（橙色）。OxPhos，氧化磷酸化。g， SAL 或 LPS 处理后 CON 和 MIA 后代的血清 IL-6。n 值表示单个小鼠。使用线性混合效应模型进行分析，该模型显示 LPS 效应，但没有 MIA 效应。h， CD68 的百分比
在背侧 （D） 和腹侧 （V） 纹状体 （Str） 的小胶质细胞内。n 值表示单个单元格。使用三向方差分析 （ANOVA） （MIA、LPS、区域） 和 emmeans 事后检验进行统计分析。我们发现 MIA 具有显着的主效应，在 LPS 治疗后，两个大脑区域 MIA 与 CON 小胶质细胞的事后检验具有显着的意义。i，使用 Sholl 分析的小胶质细胞形态。n 值表示单个单元格。数据均为 ± s.e.m. 的平均值。使用线性混合效应模型进行分析。MIA 组与 LPS 治疗 （× Trt 组） 的治疗 （Trt） 、脑区 （region） 和交互作用有显著影响。j，对大约 120,000 个小胶质细胞进行均匀流形近似和投影 （UMAP） 分析，分为 11 个簇。显示了差异丰度分析，量化了从每只小鼠到每个簇的细胞百分比。n 值表示单个小鼠。使用双侧 t 检验进行统计分析。k， CON 和 MIA 小胶质细胞簇 2、5 和 11 的不同标记基因的基因表达 （log）。n 值表示单个单元格。*P < 0.05。AU，任意单位。g、h 和 j 中的箱形图显示中位数（中心线）、四分位距（IQR;箱线限制）和 1.5 × IQR（须线）。统计分析的详情见补充表 1。
自然风光 |第 610 卷 |13 年 10月 2022 日 |329
具体来说，与 CON 小胶质细胞相比，71% 的 LPS 诱导基因 （2,260） 在 MIA 小胶质细胞中的诱导减少（基因表达降低）（图 1d 和扩展数据图 2）。同样，与 CON 小胶质细胞相比，65% 的 LPS 抑制基因 （1,946） 在 MIA 中显示出抑制减弱（基因表达增加）（图 1d 和扩展数据图 2）。总之，这些结果表明，与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞的免疫反应减弱，其中变钝基因定义为与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞中 LPS 反应绝对倍数变化较小的任何基因。我们还通过对倍数变化值拟合回归线来证明免疫减弱，比较 CON 和 MIA 小胶质细胞之间的 LPS 反应，斜率约为 0.7，一致系数约为 0.8，均小于 1（图 1e 和扩展数据图 2）。这些数据与 MIA 中过度活跃的免疫反应的预期形成鲜明对比。
为了从功能上表征这一结果，我们比较了两个独立的基因集富集分析，以确定 MIA 和 CON 小胶质细胞在成年期对体内 LPS 治疗的反应中差异富集的特定分子途径。我们发现 MIA 小胶质细胞中的先天免疫反应通路（包括干扰素信号传导）强烈减少（图 1f）。此外，我们发现 MIA 小胶质细胞中三羧酸循环和脂肪酸代谢的增强，同时氧化磷酸化、氧化还原途径、电子传递链和呼吸途径的减少（图 1f）。在 MIA 小胶质细胞中观察到的线粒体途径失衡表明免疫代谢反应受损。总之，这些结果强调了在小胶质细胞中实施的广泛功能适应，以响应母体微环境的变化。
接下来，我们讨论了成人 MIA 小胶质细胞中 LPS 反应迟钝是否存在区域特异性。我们发现，与 CON 小胶质细胞相比，来自额叶皮层和纹状体的 MIA 小胶质细胞都显示出较弱的免疫反应，但纹状体显示出比额叶皮层更强大的效果（扩展数据图 3a、b）。为了确定免疫减弱对 MIA 小胶质细胞的特异性，而不是数据中的偏倚，我们比较了来自额叶皮层的小胶质细胞和来自纹状体的小胶质细胞之间的 LPS 反应（将 CON 和 MIA 混合在一起），发现免疫反应更加一致（斜率 = 0.9，一致性系数 （CCC） = 0.9），表明减弱的免疫反应是 MIA 小胶质细胞特异性的（扩展数据图 3c-e）。此外，通过血清白细胞介素 6 （IL-6） 测量，MIA 和 CON 后代对 LPS 治疗的外周免疫反应没有差异，表明外周免疫反应正常（图 1g）。总之，免疫反应性降低是与大脑中 MIA 小胶质细胞相关的特定特征。
接下来，我们使用组织学对成年后代的体内观察进行了功能验证（图 1h，i 和扩展数据图 4）。我们测量了背侧和腹侧纹状体中成年小胶质细胞的密度、形态和溶酶体含量（图 1h、i 和扩展数据图 4），因为纹状体小胶质细胞显示出更强的免疫表型（扩展数据图 3a、b）。与免疫反应性减弱一致，我们发现在体内 LPS 处理后，与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞的 CD68 溶酶体较少（图 1h 和扩展数据图 4b-d）。此外，LPS 处理后 MIA 小胶质细胞显著小于 CON 小胶质细胞，尽管 SAL 处理后形态学差异可以忽略不计，表明 MIA 小胶质细胞的反应性受损（图 1i 和扩展数据图 4a）。SAL 和 LPS 处理后小胶质细胞密度保持不变（扩展数据图 4e）。总之，这些数据通过组织学支持 MIA 小胶质细胞中的免疫反应表型减弱。
几项单细胞 RNA 测序 （RNA-seq） 研究确定了独特的小胶质细胞亚群，尤其是在神经退行性疾病中。因此，我们评估了迟钝的免疫反应表型是否发生在小胶质细胞的不同亚群中。
在所有 LPS 处理的细胞中，我们鉴定了 11 个不同的小胶质细胞簇，但与 CON 小胶质细胞相比，MIA 小胶质细胞没有明显的簇（图 1j，k 和扩展数据图 5a-c）。接下来，我们进行了丰度测定，以量化每个样品中细胞与每个簇的比例。我们发现 MIA 在促炎簇 2 （Ccl3） 中的丰度降低，在簇 5 （Ccl12） 和簇 11 （干扰素簇，Ifit2 Cxcl10） 中呈下降趋势 （图 1j，k 和扩展数据图 5）。这些数据表明 MIA 影响一些促炎簇，这与在大量 RNA-seq 分析中观察到的 MIA 小胶质细胞免疫表型减弱的想法一致。
发育中的钝化 MIA 小胶质细胞反应性
接下来，我们通过从 MIA 和 CON 后代的纹状体和皮层中提取小胶质细胞并在体外培养原代小胶质细胞，解决了 MIA 后发育过程中小胶质细胞的免疫反应性。这使我们能够表征胚胎小胶质细胞的免疫反应性，并获得与体内数据的互补结果。我们在体外用 LPS 刺激提取的小胶质细胞，并定量细胞因子 IL-6 和 TNFα 从小胶质细胞分泌到培养基中。与体内数据一致，我们发现与 CON 小胶质细胞相比，来自 MIA 后代纹状体的成体小胶质细胞显示分泌的促炎细胞因子减少（图 2a）。重要的是，与纹状体的 CON 小胶质细胞相比，在 MIA 的 E18 处观察到类似的免疫反应减弱，表明存在长寿命的免疫迟钝表型（图 2a）。在皮质小胶质细胞中，MIA 在成年期显示免疫反应轻度降低，在 E18 时没有显着变化，表明皮层具有延迟和较温和的免疫钝化表型，这可能是由于皮质发育成熟较晚与纹状体相比（图 2b）。这些体外数据表明，产前免疫应激源诱导了 MIA 小胶质细胞对后续免疫刺激的激活长期迟钝，这与小胶质细胞在成年期对体内刺激的反应迟钝一致。
新生儿大脑包含内源性应激源，可诱导小胶质细胞变得反应性。因此，通过直接检查新鲜提取的新生儿大脑的体内小胶质细胞，我们可以评估 MIA 小胶质细胞对内在激活剂的响应性。我们在新生儿 MIA 和 CON 小胶质细胞之间发现了 2,034 个 DEGs（图 2c-e）。与成年期 LPS 激活的小胶质细胞类似（图 1b、f），新生儿 MIA 和 CON 小胶质细胞之间的这些 DEG 显示与免疫反应、吞噬作用、RNA 加工和蛋白质定位相关的通路减少（图 2d、e）。此外，在新生儿（内在激活）小胶质细胞和成人 LPS 处理的小胶质细胞中，这些 DEGs 中的 123 个通常发生变化 （假发现率 （FDR） < 0.1）（图 2f）。大多数基因在新生小胶质细胞 （88 个基因） 和成人 LPS 处理的小胶质细胞 （75 个基因） 中下调 （图 2f）。这些基因在功能上与先天免疫反应相关，并富集于干扰素途径的靶基因 （IRF1、IRF2、IRF7 和 IRF8） （图 2f）。总之，MIA 导致小胶质细胞对新生儿阶段的内源性激活和成年期 LPS 的外源性激活的反应性降低，并导致重叠功能通路受损。
我们还通过检查全基因组关联研究 （GWAS） 的数据集，确定了数据集中 MIA 和 CON 之间的 DEGs 是否富集了疾病相关风险基因。我们发现，MIA 和 CON 之间的 DEGs 对精神分裂症风险基因的富集程度高于自闭症谱系障碍、注意力缺陷多动障碍、双相情感障碍和重度抑郁症的风险基因（图 2g）。精神分裂症是一种神经发育起源的综合征，症状在青春期后出现，与儿童发病的发育状况相反，如自闭症谱系障碍和注意力缺陷多动障碍，或成人发病的情况，如
330 元 |自然风光 |第 610 卷 |13 十月 2022
品
a
c
Immune
DNA processing
RNA processing
Protein
localization
Synapse
Hydrolase
Lytic vacuole
Extracellular matrix
Cell junction
adhesion
Proliferation
Growth factor
Migration
Other
Mesenchymal
Angiogenesis
–2.5
2.5
Pathway analysis
(MIA/CON)
NES
−1.0
−0.5
0
0.5
1.0
2
)
E18
IL-6 TNFα
*
*
*
*
IL-6 TNFα
e
f
−1.0
−0.5
0
0.5
1.0
2
)
IL-6 TNFα
IL-6 TNFα
P = 0.06
E18
CON
MIA
−2
−1
0
1
2
d
g
b
1,066
968
Itgb2
Ramp2
LsrEsam
Apoe
Gstm7
Sema6a
Slc1a4 Flt4
Ly75
Man2b2 Fmnl1
0
10
20
30
−2
0
2
4
P
10
)
P< 0.05 NS
P4
LPS
Up 35
Down 88
Up
27
Down
8
Up
13
Down
75
TF: TEF
TF: KDM7A
TF: HMGB
TF: CIITA
Other: 2
Other: 17
Blunted repression 11
Other: 4
Other: 1
Blunted
induction 7
Blunted
repression
23
Blunted
induction 58
0
1
2
3
4
5
ADHD
ASD
BP
MDD SZ
DEG
Non-DEG
Genes in GWAS (%)
*
DEG
(3,431)
13
95
54
42
155
Non-DEG
(17,606)
49
367
184
133
541
Dis.