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     第 3 章


肽全局去保护/清除剂诱导的副反应


无需在固体载体上成功组装靶肽链
清楚地表明了SPPS的最终胜利。以下的 immobi 支队-
来自固体支持物的化肽（肽裂解）和
侧链保护组（Global Deprotection）也极具决定性
为了相关肽合成的成功。 并且 常规
用作酸，用于肽裂解和全局去保护
Boc化学和Fmoc化学的范围。劈裂保护
基团以碳正离子、 磺基的形式存在于反应系统中
Nyl阳离子或其他 衍生物 在被相应的淬灭之前
清道夫。然而，这些反应性亲电物质可以与
肽侧链上释放的亲核官能团
例如，Met上的硫醚基团， Tyr上的酚醛基团， Trp上的吲哚基，
Ser/Thr 上的羟基、 Cys 上的巯基 和 Arg 上的胍， 在任一
以可逆或不可逆的方式，并产生多样化的加合物副产物。
为了防止或尽量减少此类副反应的发生，适当
吃的亲核试剂 应该同时被电荷成 TFA 或 HF
裂解溶液，以保护肽的全局脱保护反应，通过以下方法
原位捕获降解的碳正离子、磺酰基阳离子和其他 REAC
tive 物种。通过这种方式，官能团的均匀性从
目标肽是有保证的，在肽裂解和全局的过程中 去保护
即使从目标肽中释放出的官能团产生
UCT 受到在步骤中添加的清除剂的屏蔽效果的保护
肽裂解和全局去保护，各种副反应仍可能
不可避免地会发生，并产生相应的杂质。科尔
本章的内容将重点介绍行为、机制和电位
在肽裂解过程中调用的这些副反应的解决方案和 全球去保护。


3.1 肽全局脱保护过程中Trp的叔丁基化副反应


Trp 侧链中脆弱的吲哚基团在肽全局去保护（如叔丁基化）过程中可能会发生过多的副反应; 烷基化反应由树脂降解的间隔阳离子进行烷基化， 磺 化反应由 相应的Arg侧链保护基团衍生的离子氧化和 二聚化。 本节将详细阐述影响Trp上Dolyl侧链的叔丁基化副反应。

基本上，在肽组装过程中使用的亲核试剂通常不会对Trp吲哚基侧链构成严重挑战（在酰基叠氮化物衍生物 的制备过程中可能会发生Trpindolyl硝化）。在其吲哚基侧链上受保护的 Trp 通常在无酸环境中免于烷基化副反应。然而，在引入TFA去除Trp上的保护基团后，原本屏蔽的吲哚官能团现在暴露在含有丰富亲电物质的环境中，如叔丁基阳离子、磺酰基阳离子、酰基阳离子、苄基阳离子等。因此，Trp上未受保护的吲哚基侧链与这些反应性衍生物的不可逆反应是在酸性环境中触发的。

在酸性条件下，Trp上的吲哚基侧链相当容易受到亲电攻击，并且该修饰主要解决其2-位问题。 其他吲哚基位置也受到烷基化衍生化和多重烷基化副反应的影响，在某些情况下，Trp 残基可能会发生这些反应。 在用强碱处理时可能会去质子化，并暴露于吲哚阴离子形式的各种副反应中。在这种情况下，主要的修饰位点是1位（另见图3.1）。

叔丁基化是影响亲核 Trp-吲哚基侧链的最常发生的烷基化副反应之一。在Fmoc模式肽合成过程中，一些反应性氨基酸，例如Ser，Thr，Tyr，Asp或Glu在其侧链上以叔丁基醚或叔丁酯的形式受到保护。叔丁基阳离子是在对由这些残基组成的保护肽前体进行反式反应处理时生成的。释放的叔丁基阳离子可能与反应体系中丰富的TFA进一步发挥作用，形成反应性物质三氟乙酸叔丁酯， 这被认为是导致肽全局脱保护中叔丁基化副反应的罪魁祸首之一。 其他叔丁基化资源，如Boc保护基团，在TFA处理后被分解。Boc酸解的可能机理如图3.2所示。 在此过程中释放出异丁烯，后者在TFA溶液中被质子化并转化为叔丁基阳离子，或者，异丁烯可能与TFA反应生成三氟乙酸叔丁酯。同时，也有报道称，Boc在酸解时直接降解为叔丁基阳离子。
 E：亲电试剂
 X：离开组

图 3.1 酸/碱性条件下对 Trp-吲哚基侧链的亲电攻击。

图3.2 Boc酸解工艺的机理

肽全局脱保护中生成的丰富的叔丁基阳离子和叔丁基三氟乙酸盐可能被肽上各种反应性亲核官能团以烷化剂的形式捕获，其中Trp-吲哚基和Cys-巯基可能参与其中。Trp叔丁基化过程如图3.3所示。Trp上的去保护吲哚官能团可以与叔丁基阳离子或三氟乙酸叔丁酯反应，产生相应的叔丁基化 衍生物，分子量相对于目标产物增加+56 amu。这种叔丁基化过程基本上可以在吲哚基环上的所有反应位置进行，但绝大多数发生在 2 位。

图3.3 叔丁基阳离子和三氟乙酸叔丁酯诱导 的侧链烷基化反应

引入适当的保护基团 是防止叔丁基化副反应的最有效方法之一。Boc是Trp最适用的保护基团之一，已经证实， -Boc保护的Trp衍生物，即使位于Trp叔丁基化的敏感序列中，与其侧链未受保护的对应物相比，也明显不受叔丁基化 和磺化 副反应的影响。

-Trp上的Boc保护基团可以逐步被TFA彻底切割。该过程如图 3.4 所示。Trp（Boc）衍生物 在TFA处理后首先转化为其氨基甲酸酯对应物2。 这个过程进行得相当迅速，化合物 的稳定性非常高，甚至可以被分离出来。受影响的吲哚基环上的羧基可以很容易地被弱酸去除，以再生目标侧链去保护产物3。这种p-Boc 裂解过程的 逐步模式明显有利于维持Trp吲哚基侧链的完整性，并避免肽全局脱保护过程中的烷基化副反应。当Ser、Thr、Asp、Glu、Tyr、Arg等残基在酸处理后侧链脱保护时，大量的碳正离子和磺酰基阳离子被释放到反应体系中，这些亲电物质可能会攻击Trp侧链上释放的吲哚基环

图 3.4 Trp上-Boc保护基团的 酸裂解。 它们没有被充分清除。同时， Trp上的保护基团同时发生降解，但在Trp-氨基甲酸酯中间体的步骤中可以保留酸解过程。Trp吲哚基环上羧基的存在不仅可以保护1-位免受各种反应性阳离子物种的潜在亲电攻击，而且可以降低另一个吲哚基位的亲核性，这些亲核性可能容易受到烷基化或磺化等不同副反应的影响，从而确保TFA介导的肽全局脱保护过程中相关Trp残基的完整性。

在肽全局脱氧反应中通常添加适当的清除剂，以驱动针对反式脂肪酸的竞争反应，以捕获和灭活释放的叔丁基阳离子。此外，生成的反应性三氟乙酸叔丁酯也会被这些添加的清除剂淬灭。例如，试剂 苯酚/5% 硫茴香醚/2.5%EDT）可以有效抑制肽整体脱保护过程中影响Trp上吲哚环的副反应。 在试剂K的成分中，EDT在清除叔丁基阳离子和三氟乙酸叔丁酯方面表现出最有效的性能。 除此之外，水是另一种用于淬灭叔丁基阳离子和三氟乙酸叔丁酯的良好试剂。 在肽全局脱保护中利用这些清除剂，结合适当的Trp侧链保护策略，可以有效抑制肽合成过程中的Trp-叔丁基化副反应。


3.2 Trp 在树脂连接剂阳离子的过程中进行烷基化反应


肽裂解/全局去保护


除了脆弱的Trp残基在肽裂解/全局去保护步骤中遭受的叔丁基化副反应外，在此过程中还可能调用其他不需要的Trp修饰，例如降解的接头阳离子介导的Trp烷基化。 这种副反应的主要原因是酸诱导的接头酸解碎裂，锚定在固体载体上。在此过程中，接头片段以各种阳离子的形式释放到溶液相中，这些阳离子可以通过亲电加成的方式攻击Trp上的吲哚基环。或者，如果这些反应性阳离子衍生物在肽裂解过程中仍保留在未淬灭的固体载体上，则这些亲核试剂与释放的Trp吲哚基侧链之间的反应将导致受影响的肽链不可逆地固定在固体载体 上，并因此降低产量。以Wang树脂和HMPA树脂为例，这两种酸不稳定的树脂在浓缩TFA溶液处理后都能产生相应的肽酸产物。所需裂变是相应肽链的 C 末端与锚定在固体载体上的接头之间的裂变，将肽产物从树脂中释放出来（另见图 3.5，位点 A）。然而，在某些情况下，潜在的酸不稳定烷基苯醚键也可能受到

图 3.5 Wang和HMPA-AM肽基树脂的酸解。

在高浓度TFA溶液 中酸解（另见图3.5，B位点）。如果在TFA介导的肽裂解/全局脱保护反应中，Wang或HMPA-AM树脂的A位点和B位点同时发生裂解，则会产生4-羟基苄基阳离子4，并因此 释放到肽溶液中（图3.5）

除了Wang和HMPA上的羟甲基苯氧基型连接子外，其他一些用于肽酰胺合成的SPPS官能树脂，如Rink树脂、Rink酰胺MBHA树脂和PAL树脂[（5-（4-（9-芴基甲基氧羰基）氨甲基-3,5-二甲氧基苯氧基）戊酸]也可能受到间隔物与其相应的固体支撑骨架之间不希望的酸水解裂解的影响。 如图3.6所示，如果肽基PAL-MBHA树脂的酸处理导致A位点出现规则碎裂，B位点出现意外裂变，则 会产生PAL衍生的5-（3,5-二甲氧基-4-甲基苯氧基）戊酰胺阳离子，并在此过程中释放到溶液相中;同样，肽基Rink树脂位点 和 位点的不规则酸解产生4-羟基苄基阳离子 ，肽基Rink MBHA树脂上B位点和C位点同时误入裂解，释放出阳离子2-（4-甲基苯氧基）乙酰胺 。所有这些阳离子都是从相应的间隔物和树脂骨架之间的不需要的裂解中释放出来的，如果它们在肽裂解步骤中没有被充分清除，由于它们固有的亲电特性，可能会触发副反应。

在肽基树脂裂解过程中，受连接阳离子烷基化修饰影响最大的氨基酸之一是Trp侧链上的吲哚环。如上一节所述，Trp容易受到烷基化的影响，例如，在肽侧链全局脱保护过程中释放和形成的叔丁基阳离子和/或三氟乙酸叔丁酯驱动的叔丁基化。然而，本节中讨论的由分解的树脂接头阳离子决定的烷基化副反应发生在肽基树脂裂解/全局脱保护“二合一”步骤中。如果这些反应性阳离子物质不能在此过程中得到充分和及时的淬灭
 Peptide-Rink 树脂

图 3.6 PAL、Rink 和 Rink MBHA 肽基树脂的 TFA 酸解。

在上述反应中，它们可能会在肽上诱导释放的官能团发生烷基化修饰，并形成多样化的侧链修饰肽杂质。Trp吲哚基与这些分解的阳离子连接剂之间的不可逆反应将不可避免地导致烷基化副反应的 发生。如图 3.7 所示，如果未受保护的侧链 Trp 被不同的 SPPS 树脂间隔阳离子包封，它将被扭曲成不同的烷基化副产物，例如，MW 增加 106 amu 的衍生物 ，由 4-羟基苄基阳离子 4 调用。同样，烷基化的Trp杂质 是由分解的PAL连接子片段5-（3,5-二甲氧基-4-甲基苯氧基）戊酰胺猫离子5引起的。而Trp杂质 是通过2-（4-甲基苯氧基）乙酰胺阳离子6通过二烯基侧链烷基化过程衍生而来的。同样，释放的4-羟基苄基阳离子4可以与反应体系中丰富的TFA分子一起发挥作用，并形成阳离子型4-三氟乙酰氧基苄基阳离子7，从而改变Trp残基上的游离吲哚环，并导致形成副产物 ，其分子量增加

与 Trp 叔丁基化类似，大多数由间隔阳离子引发的上述烷基化副反应发生在吲哚基环的 2 位上，而在

在某些情况下，可能会发生多个苄基化。 这些副反应的概率和程度可能与序列有关，也就是说，在肽基树脂裂解/全局脱保护步骤中，某种Trp残基是否会受到连接子阳离子指示的烷基化的影响，这部分取决于所接触的Tr残基在相关肽序列中的位置。然而，Trp对烷基化的敏感性与其顺序位置之间的明确相关性尚未得到明确澄清，并且确实存在对此的矛盾结论。

已经开发了针对分解的 SPPS 树脂间隔物介导的 Trp 修饰的靶向策略。将原始的一步切割策略转化为逐步切割/全局脱保护过程，可以主要提高粗品的完整性，并降低一步肽切割过程中必需的高浓度TFA溶液对接头分解的敏感性。通过用稀释的TFA溶液处理高度酸不稳定的肽基树脂，可以得到完全侧链保护的肽前体，以这种方式绕过高浓度TFA的使用，因为高浓度TFA可能会夸大树脂间隔物的不规则碎裂，并因此通过释放的间隔物猫离子诱导Trp烷基化。完全侧链保护的肽衍生物随后可以被处理到一个专用的单独侧链保护基团切割步骤，该步骤同时去除相应侧链上的不同保护基团。对于Trp苄基化副反应特别容易发生的情况，利用超酸敏感的SPPS固体载体，例如CTC树脂或Sieber树脂分别用于制备肽酸和酰胺，被认为是解决问题的合理策略。在用稀释的TFA溶液处理肽基树脂的过程中，Trp的吲哚基侧链上的Boc保护基保持完整，从而防止了反应体系中各种反应性阳离子可能发生的Trp烷基化修饰。这种逐步分解肽基树脂和全局脱保护策略可以在很大程度上抑制由分解的SPPS树脂阳离子引发的Trp苄基化副反应。

缓解上述副反应的另一种策略是利用具有对强酸处理具有独特抵抗力的间隔物的SPPS树脂，从而最大限度地减少该过程中的异常间隔物分解。以Wang树脂为例，它是一种采用 烷氧基苯甲醇作为间隔物的常规树脂，容易发生酸解副反应，因此，新一代的Wang树脂通过引入供电子基团来改变其 与羟甲基的位置 ，该基团增强了相应间隔物对强酸的稳定性。 许多没有不规则碎裂的新型SPPS树脂垫片被设计并应用于SPPS （另见图3.8）。据报道，如果像 PAL 或 Rink 这样的功能性间隔物与固体支持物上的氨基甲基而不是 MBHA 基团相连，则它们可能不太容易受到酸解的影响（Yang， Y.，未发表的结果）。 氨甲基连接的SPPS树脂间隔剂

图 3.8 酸稳定的 SPPS 树脂垫片。

即使在HF存在下也能保持稳定，因此免于不需要的酸解副反应。

在肽裂解过程中，SPPS树脂间隔区酸水解分解的程度明显与酸浓度成正比。 如果用于肽裂解的TFA溶液浓度升高，则间隔阳离子引起的Trp苄基化的严重程度可能会相应增加。因此，在这个过程中，通过对所应用的TFA溶液的浓度进行细致的微调，可以实现对这种副反应的抑制。此外，缩短肽基树脂酸处理的持续时间也有助于减少降解树脂间隔阳离子对Trp的修饰程度。

在修饰或选择SPPS树脂间隔剂的空间非常有限的情况下，抑制不需要的树脂间隔剂分解和随后的Trp烷基化的最有效策略是在TFA溶液中添加适当的亲核清除剂。这些清除衍生物可以充分有效地捕获释放的间隔阳离子，然后才能对Trp上的吲哚基环进行短暂的亲电攻击。变异研究证明，合理配制肽基树脂裂解/全局脱保护溶液是抑制Trp烷基化副反应的最理想策略。Albericio等人 发现，清除剂，例如苯酚硫酚、苄硫醇、亚磷酸二甲酯和三 丁基膦在淬灭PAL衍生的5-（3,5-二甲氧基-4-甲基苯氧基）戊酰胺阳离子和防止目标肽中的Trp残基被烷基化方面相对无效;另一方面，试剂R（苯甲醚/硫代苯甲醚/EDT）可以有效保护Trp残基免受PAL接头阳离子的亲电攻击。在另一项研究中 发现，苯甲醚是一种极好的添加剂，可以通过间隔阳离子衍生物抑制Trp烷基化，而当EDT/TIS代替苯甲醚被装入去保护混合物中以产生cor反应肽的整体去保护时，这种副反应被强烈刺激。Stathopoulos等人 发现，在TFA/TIS体系中添加1,3-二甲氧基苯可以显著抑制肽C末端4-羟基苄酰胺杂质的形成。该副反应的发生与 Trp 无关，而是由于图 3 中描绘的 B 和 C 位点的异常键裂变。6.在肽-Rink树脂方面。据笔者推断，DMB（1,3-二甲氧基苯）在抑制B位点不规则键断裂的背景下的性质归因于DMB与B位点间隔键断裂所衍生的物质之间的结构相似性。因此，在肽-Rink树脂裂解/肽全局脱保护中添加DFB可能会影响强酸性环境中潜在间隔物分解的平衡。因此，不规则树脂间隔物降解和反应间隔阳离子的形成被最小化，从而保证了Trp的完整性。然而，这种改进并不是通过DMB清除释放的苄基阳离子衍生物的效果来实现的


3.3 Trp-EDT和Trp-EDT-TFA加合物的形成


IN 肽全局去保护


在TFA介导的肽侧链全局脱保护步骤中，含Trp的肽容易受到许多潜在副反应的影响，其中叔丁基阳离子/三氟乙酸叔丁酯诱导的叔丁基化和苄基化，以及树脂间隔阳离子，在前几节中已经介绍过。此外，在该步骤中，一些易受攻击的Trp残基也受到TFA/EDT指令修饰的影响，并因此转化为环状二硫代缩醛加合物。 在此过程中形成的副产物是Trp衍生物，该衍生物 在吲哚基环的2位（另见图3.9）处修饰，分子量相对于母体分子增加172 amu。

该副反应首先在肽侧链全局脱保护反应 中检测到，其中 15 当量的 EDT 作为清除剂被充电到 TFA/ 溶液中。当将相关肽侧链全局脱保护反应的温度提高到 定量地将Mtr保护基团从Arg侧链上切割出来时，检测到分子量相对于目标产物增加172 amu的副产物。核磁共振证实其化学结构为Trp衍生物在吲哚侧链的2位被TFA/EDT修饰为五元环二硫代缩醛12（图3.9）。此外，还进行了专门的实验来研究TFA/EDT对Trp的修饰
12

图 3.9 Trp-TFA-EDT加合物的形成。

冷凝（杨，未发表的结果）。Fmoc-Trp（Boc）-OH经TFA/EDT A介导的侧链疏离反应，肽溶液在高温下应激过夜，反应体系中发现富量的衍生物，分子量为598.7 amu（Fmoc-Trp-OH的分子量为426.5 ），与Fmoc-Trp-OH的TFA/EDT二硫代缩醛加合物一致

环状二硫代缩醛的形成是二硫醇衍生物和羰基化合物之间的普通酸催化有机反应，通常用于暂时保护羰基官能团。 例如，1,3-二硫杂环戊烷相关化合物可以通过酸催化1,2-乙二硫醇与相应的羰基试剂之间的缩合得到。 在一项研究中 发现，当EDT作为清除剂被装入肽的全局脱保护反应中时，在含有Bpa的肽的化学制备过程中出现了大量的杂质 。所引用的副产物被鉴定为通过半巯基缩醛中间体 形成的二硫代缩醛加合物 （图3.10）。值得注意的是，在全局脱保护混合物中，DTT代替EDT不会诱导类似的二硫代缩醛缩合，这表明该副反应的发生与空间效应（例如相应二硫代缩醛衍生物的稳定性）具有内在的相关性

关于通过EDT/TFA缩合纠缠在上述 修饰中的肽合成，没有深入研究，但+172 amu MW的杂质仍然困扰着大量的肽生产。一些受影响的肽没有成分Trp残基（Yang，未发表的结果），这种现象可能暗示TFA/EDT缩合的二硫代缩醛阳离子 在其攻击相应底物之前形成，例如Trp上的吲哚环，或其他芳香族残基，如Tyr或Phe在酸性条件下，产生MW增加172 amu的副产物。

在高温下，这种副反应在肽全局脱保护中基本上会加剧，这被认为是定量去除一些酸不稳定的保护基团的必要条件，例如Arg上的Mtr或Pmc

图 3.10 EDT/TFA诱导的二硫代缩醛在含BPA的肽上缩合。侧链。 较高的温度可能有助于TFA-EDT二硫代缩醛阳离子的形成，并促进其对相应底物残基（如Trp、Phe或Tyr）的亲电攻击。因此，设计和利用了新型的Arg保护基团，例如MIS（1,2-二甲基吲哚-3-磺酰基）， 以解决肽侧链全局脱保护反应过程中固有相关的副反应。与去除常规Arg保护基团（如Pmc、Mtr甚至Pbf）相比，MIS保护基团可以在更温和的条件下从Arg侧链上切割，以这种方式绕过不利的高温条件，并抑制Trp上潜在的二硫代缩醛缩合。

为了尽量减少Trp上不需要的二硫代缩醛修饰，另一种策略是通过阻断TFA-EDT二硫代缩醛阳离子物种的形成来解决这种副反应的根本原因。鉴于上述观察结果，即含Bpa的肽几乎不受TFA-DTT me扩张全局脱保护的影响，因此建议相应地制备肽全局脱保护溶液，其中EDT被DTT或其他巯基 衍生物（如1,8-辛烷二硫醇）取代。在相应的肽侧链全局去保护中采用这种微调的脱保护混合物可以有效抑制二硫代缩醛修饰在敏感残基上的发生。此外，合理缩短全球去保护的持续时间也可能减少这种副反应的程度。Trp吲哚基侧链上的 -Boc保护，即使在酸解过程中以瞬时氨基甲酸酯保护的形式存在，也会大大降低其2位电子云的密度，并使其不易被各种亲电试剂修饰


3.4 Trp二聚化副反应过程中


多肽全局去保护


Trp二聚化的行为对所接触蛋白质的生理性质产生了非常显着的影响。 在肽化学合成的情况下，Trp侧链上的吲哚环也可能经历二聚化过程，这可能与体内蛋白质二聚化在相应键连接的背景下存在本质上的差异。通过Trp吲哚基侧链的二聚化肽在紫外和荧光光谱方面表现出相对于其单体对应物的不同行为，并且它们的空间构象和稳定性也会 发生变化

通过 Trp 的肽二聚化主要发生在 TFA 或 HF 介导的肽侧链全局脱保护步骤中， 该脱保护是由强酸的存在催化的。这种侧反应的机理在某种程度上类似于Mannich型二聚化（另见图3.11）。 作为结果，来自各自肽的两个 残基在吲哚基环上的它们的 2 位连接。 整个过程是由阳离子 衍生物15通过质子化形成而开始的，即

图 3.11 酸催化Trp二聚化的机理。

随后从另一个中性Trp进行亲核攻击，并生成阳离子中间体16。这种二聚体衍生物经历自发的去质子化过程，产生稳定的吲哚-吲哚啉产物 17 类似的二聚化过程也可能发生在其他吲哚衍生物上，例如，吲哚-3-乙酸可以在 TFA 处理后转化为 2，''-吲哚-吲哚啉二聚体。

吲哚-吲哚啉衍生物 在酸存在下可以进一步氧化为相应的吲哚-吲哚二聚体对应物 （图3.12）。例如，用TFA和DDQ连续处理含Trp的肽可以引起分子内或分子间吲哚吲哚二聚体肽产物的形成。 吲哚-吲哚啉二聚体 也可以在较温和的条件下被氧化，例如，空气氧化或光照射 到相应的吲哚-吲哚对应物18。

Trp二聚化的程度显然与TFA处理肽的持续时间成正比。 因此，建议合理缩短肽的全局脱保护反应，以尽量减少潜在的Trp二聚化。Boc 保护的 Trp 也已被证实不太容易受到这种副反应的影响。
17
18

图 3.12 吲哚-吲哚啉衍生物氧化为吲哚-吲哚二聚体


3.5 肽全球期间 Trp 减少

 去保护


三烷基硅烷家族在酸性条件下可作为温和的还原剂。与Si原子相连的取代基物质对 键的性质至关重要，因此被认为是相关母体三烷基硅烷化合物还原潜力的关键因素。该家族还可用作肽侧链全局脱保护反应中的清除剂，用于淬灭反应性阳离子物种，特别是相对稳定的Trt阳离子。在Trt阳离子清除方面，三烷基硅烷表现出优于EDT的性能。 在大多数情况下，酸性环境中的三烷基硅烷可以被视为离子氢化过程中的氢供体。 在肽全局脱保护步骤中，从相应的受保护氨基酸前体释放的稳定阳离子，例如Trt、Acm和Tmob阳离子，可以被三甲基硅烷不可逆地捕获，并转化为惰性三苯基甲烷（另见图3.13），通过这种方法促进Trt保护基团的有效裂解，并抑制电位报复副反应，前提是释放的Trt阳离子没有得到充分的淬灭

在肽合成方面，最常用的三烷基硅烷化合物包括TIS和TES。TIS上大块的异丙基取代基赋予分子明显的空间效应，这可以通过反应选择性的特性得到很好的体现。另一方面，TES的价格明显低于TIS，这对于肽物质的工业生产具有明显的优势，并且经常采用TES代替TIS，以降低相应肽的生产成本。

与体积较大的TIS相比，TES本质上具有更强的减排潜力。然而，这一特殊特性可能导致在酸性条件下吲哚衍生物意外还原为相应的吲哚啉。 根据该过程，在TES存在下，在肽侧链全局脱保护的步骤中，可以诱导Trp转化为分子量增加2 amu的Trp-吲哚啉对应物 （另见图3.14）。这种还原副反应可能是由于在TFA处理后形成相对稳定的阳离子Trp中间体而引发的（见

图 3.13 三烷基硅烷对Trt阳离子的清除。

图 3.14 TES诱导的Trp降低

也如图3.11），其随后被TES还原为相应的吲哚啉衍生物。该过程的机理基本上类似于在酸性条件下通过三烷基硅烷将烯烃还原为相应的烷烃。58 ,59

与肽合成中针对Trp的最副反应类似，在Boc保护吲哚基侧链的情况下，三烷基硅烷对Trp的还原将得到有效抑制。 TIS代替TES作为肽全局去保护的清除剂，也可以大大抑制酸性环境中Tr减少的发生。


3.6 多肽全球过程中的Cys烷基化

 去保护


Cys侧链上的巯基官能团可能在肽侧链全局脱保护反应中发生Ir可逆烷基化副反应。源自Boc或tBu保护基团的叔丁基阳离子和三氟乙酸叔丁酯，如果没有得到适当和充分的淬灭，在酸性条件下，可能会与Cys侧链上的巯基一起发挥作用， 并导致叔丁基硫醚杂质 的形成（另见图3.15）

与该副反应类似，Cys也可以在肽侧链全局脱保护过程中被Tr阳离子可逆修饰，并转换回 衍生物（另见图3.16）

解决Cys巯基侧链上各种烷基化副反应的最有效解决方案是使用适当的清除剂，这些清除剂能够在肽过程中充分捕获释放的阳离子
19

IGURE 3.15 Cys 叔丁基化。

图 3.16 Cys的三苯甲基化。

侧链全局脱保护反应，并保护释放的巯基免受这些阳离子烷化剂的潜在亲电攻击。EDT 已被证明是叔丁基猫离子最有效的清除剂之一，而 TES 或 TIS 等三烷基硅烷可以有效淬灭 Trt 阳离子此外，TFA 溶液中用于肽侧链球形脱保护反应的这些清除剂可以有效抑制 Cys 侧链上可能有害的烷基化副反应， 从而保证了肽侧链全局脱保护反应过程中Cys巯基的完整性。


3.7 PEPTIDE GLOBAL中Cys-EDT加合物的形成

 脱保护反应


Cys上的游离巯基侧链可以通过空气介导的氧化以分子内或分子间二硫键的形式与另一个巯基共价连接。该反应通常在弱碱性条件下进行，而新形成的二硫键可能参与与其他硫代酸酯衍生物的硫醇-二硫键交换过程， 导致二硫键络合物的混淆。TFA介导的肽球脱保护过程中二硫键的意外形成和硫醇-二硫键交换很少受到关注，因此可用的相关信息相对稀缺。据报道 ， 在肽基树脂裂解和/或全局脱保护过程中，通过TFA/EDT处理的含肽20被部分转化为Cys-EDT加合物21，而使用其他清除剂代替EDT将抑制类似副反应的发生。然而，Cys衍生物22由 过早裂解产生，并形成了其二硫键二聚体 （图3.17）。

在调查中，没有明确说明先前副反应的明确机制。实际上，在肽合成过程中出现杂 质并不罕见（Yang，未发表的结果），所有这些相关情况都有一些惊人的相似之处：

图 3.17 酸处理形成Cys-EDT 加合物。

（1）受影响的靶肽含有带有游离巯基侧链的Cys残基（Cys不参与二硫键的形成）;（2）大部分易感Cys残基原本在其巯基侧链上受到Trt的保护;（3）反式脂肪酸通常用于最终的全局脱保护处理;（4）EDT是全球脱保护混合物中的成分清除剂之一。为了从宏观角度阐明前述副反应的特征，设计了不同条件下肽全局脱保护反应的系统比较，并对某些敏感肽底物进行了比较，其中DTT和EDT分别在相应的TFA溶液中起到单独清除剂的作用。在DTT参与的实验中，即使在对反应施加压力后，也没有检测到Cys-DTT加合物。相反，在EDT定向的肽全局脱保护反应中，形成了分子量相对于目标产物增加92 amu的杂质。此外，用TCEP处理该副产物可再生靶肽产物。从这些观察结果可以推断出，副产物的 形成的根本原因应归因于即使在酸性条件下，Cys上释放的巯基官能团与清除剂EDT之间也形成了二硫键，这导致了Cys-EDT加合物的发生24（另见图3.18）。

游离Cys残基与EDT（在酸性条件下）形成二硫键的倾向可能受相关Cys所在的特定微环境的影响。环境属性可能
 [中]

图 3.18 Cys-EDT加合物的形成

实质性地 影响巯基取代基在Cys上的值。 值相对较低的 Cys残基可被视为活性更高的衍生物，因为在酸性环境中，这些化合物上的硫酸盐/硫醇比率高于酸性较弱的化合物。因此，硫代酸盐将能够作为亲核试剂参与硫醇/硫代酸盐交换过程，并触发各种不需要的副反应。 例如，如果受影响的Cys的相邻残基在其侧链上带有电荷，则该Cys上的巯基取代基 的值可能明显受到其侧链带电荷的相邻残基的影响。 带正电荷的残基，例如 Lys 和 可以降低 相邻的 Cys-巯基的值，并相应地增加其亲核性，而带负电荷的 Asp 或 Glu 则相反。这种现象在一定程度上解释了在肽侧链全局脱保护反应过程中，Cys残基对EDT添加的明显倾斜性。

对于这种副反应的机理存在一些有争议的观点，其中二硫键是在 Cys 残基和各种外部硫醇化合物之间形成的。受影响的Cys可能首先通过氧化剂转化为相应的亚磺酸Cys-OH 25。 亚磺酸部分上产生的羟基将增加受害硫原子对各种硫醇或硫代酸衍生物的亲核攻击的敏感性 ，从而促进二硫化物衍生物的形成26（图3.19）。通过Cys亚磺酸中间体形成二硫键被一些研究人员认为是一个自由基过程。

另一个提出的Cys-EDT加合物形成机制与巯基-二硫键交换过程有关。在相关肽侧链全局脱保护反应中使用的EDT在储存不当时可以通过不受控制的氧化部分转化为其二硫键二聚体对应物27（图3.20）， 而这种伴随的副产物与EDT一起作为清除剂成分进入TFA介导的肽侧链全局脱保护反应。二聚体EDT衍生物27可以刺激Cys上与释放的巯基官能团进行巯基-二硫键交换，从而形成Cys-EDT加合物28。

与Cys-EDT加合物的形成过程类似，在肽生产中也经常检测到另一种与Cys相关的副产物，其分子量相对于靶产物增加了148 amu（Yang，未发表

图 3.19 Cys-SOH中间体和二硫化物衍生物的形成。

图 3.20 Cys和二聚体EDT之间的硫醇-二硫键交换。

结果），尽管这种副反应在文献中没有深入报道。与Cys-EDT加合物类似，参考副反应也解决了含Cys的肽，这些肽在肽侧链全局去保护步骤中遭受不希望的衍生化。所有受影响的肽合成都有一个相似之处，即 EDT 在相关反应中被用作清除剂成分。同样，分离出的 副产物相对于目标产物可以通过TCEP处理再生为原始的Cys衍生物，一旦使用DTT代替EDT作为清除剂组分，在所受的肽侧链全局脱保护反应中就不会产生类似的副产物。

副反应的可能机理如图3.21所示。如前所述，Cys侧链上释放的巯基取代基可以被清除剂EDT可逆修饰为Cys-EDT加合杂质29，分子量增加92 amu。由于硫醇衍生物基本上可以作为肽侧链全局脱保护过程中释放的叔丁基阳离子和叔丁基三氟乙酸酯的清除物质，因此带有游离巯基官能团的衍生物29也可以以清除剂的形式参与阳离子淬灭过程。当化合物 29 捕获周围的叔丁基阳离子或叔丁基阳离子时

三氟乙酸盐 它将不可逆地转化为相应的 Cys-EDTtBu 加合物 31，其分子量比目标 Cys 产物高 148 amu。或者，游离的EDT分子首先通过叔丁基阳离子或三氟乙酸叔丁酯在肽侧链全局脱保护反应中转化为2-（叔丁基硫代）乙硫醇 。反应性化合物随后 可以与释放的Cys巯基侧链一起发挥作用，并引起Cys-EDT-tBu加合物的形成31

尽管迄今为止尚未对CysEDT加合物衍生物形成的确切机制进行深入研究，但可以概括为：（1）在肽侧链全局脱保护反应中，非硫醇清除剂取代EDT。在许多情况下， 代替EDT可以作为叔丁基阳离子的合格清除剂。 （2）在肽生产的情况下，即在无条件需要o巯基型清除剂的情况下，可以测试替代硫醇衍生物，例如DTT，DODT或1,8-辛二硫醇。 应谨慎储存这些化合物，以避免不受控制地与空气接触并形成活性二聚体衍生物。（3）通过TCEP等还原剂对杂质进行细致的还原，可以实现目标Cys肽的再生


3.8 侧链中的肽磺化 全球

 脱保护反应


在肽合成中，与其他普通保护基团相比，Arg残基的胍侧链上的磺酰基团（如 Pbf）对TFA处理表现出相对增强的稳定性，通过这种方式在磺酰基保护基的数量去除和Arg残基的再生方面带来了不可忽视的挑战，特别是对于那些富含Arg的肽。 在肽侧链全局脱保护反应中，从Arg侧链上裂解的磺酰阳离子可能会在敏感底物上触发不希望的修饰，例如Trp、 Ser/Thr、 Tyr甚至 Arg本身 ，从而形成多样化的相应磺化副产物

肽全局脱保护步骤中磺化副反应的发生与靶肽分子上亲核磺化底物的存在以及反应过程中逃避淬灭过程的磺酰基阳离子物种的存活具有协同作用。如果没有清除剂被带入肽全局脱保护系统，则裂解掉 残基的 Pmc 阳离子可能会转化为磺酸衍生物 32，以及可能对肽上各种亲核官能团产生反应的二聚体砜 。例如，目标肽中的Trp、Tyr和Fmoc部分可能被未淬灭的磺酰阳离子修饰，并转化为Pmc-加合物34或相应的磺酸衍生物35（另见图3.22）
32
32


图 3.22 Pmc衍生化化合物诱导的磺化肽副产物。


天然蛋白质中丝氨酸和苏氨酸残基的翻译 后磺化是真核生物进化中已知的过程。 然而，在化学肽合成过程中，Trp、Tyr 和其他易感芳香族残基以及含羟基氨基酸（例如 Ser 和 Thr）可能会发生不希望的磺化。该过程主要由在肽侧链全局脱保护步骤中从Arg胍侧链上裂解的磺酰阳离子触发。 磺化氨基酸副产物 36 和在此过程中分别在侧链未受保护的Ser和Thr前体的衍生化上形成（另见图3.23）。在粗肽产品中，其侧链保护前体含有丰富的 残基，其分子量增加80 amu的倍数的磺化副产物经常被发现。这种副反应的发生可能归因于苯磺酸（例如化合物32）与反应体系中丰富的TFA分子之间的功能生成的混合酸酐衍生物CF 的形成。 这种反应性混合酸酐可以使Ser或Thr上的羟基取代基衍生化，
36

-肽
37

-肽 并引起相应的磺化副产物的形成，分子量增加80 amu。

Arg本身也可能在肽侧链全局脱保护反应中发生磺化副反应。与其他被裂解磺酰基阳离子修饰的敏感氨基酸残基不同，磺化Arg副产物 可能是由侧链磺酰基保护基的不规则裂解诱导的。 如图3.24所示，如果TFA处理后胍侧链保护基团Pbf在b位点发生磺酰胺键断裂，则Pbf保护基团将以磺酰阳离子的形式从hos Arg残基中解离，从而再生目标Arg产物。另一方面，如果在2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃和磺酰胺部分之间在位点a处发生不规则键断裂， 则将以磺化Arg杂质的方式形成衍生物38，分子量增加80 amu）。

同时，已经发现，受制的Arg残基的位置可以明显影响Arg磺化副反应的倾角和程度。 例如，如果 和 被一个氨基酸残基分离，也就是说，如果相关肽含有 -Trp-Xaa 单元，则与其他主要结构模式相比，Trp- 对 Pmc 介导的磺化副反应的敏感性将大大增强。此外，区间氨基酸的类型也会对肽侧链全局脱保护过程中磺化副反应的发生产生影响。这些现象在一定程度上支持了以下假设，即所提及的磺化副反应可能是由相关磺酰基保护基的分子内重排引发的，该基团位于来源的 Arg 残基和相应的底物（例如，Trp 上的吲哚基环）中。

从所受磺酰基保护的固有特性方面，可以制定出抑制肽侧链全局脱保护过程中不良磺化副反应的解决方案

图 3.24 Pbf 酸解模式和副产物的 形成
 管理信息系统

（1,2-二甲基吲哚-3-磺酰基）

图 3.25 Arg胍侧链保护基团MIS

组。与其他磺酰基保护基团（如Pmc）相比，Pbf即使不能彻底抑制Trp磺化副反应的发生，也可以显著减少。当寻址的Trp在其吲哚侧链上受到Boc的保护时，这种有利效果尤为明显。 新一代的Arg侧链保护基团已被相应地设计出来，并用于解决普通胍保护基团的不良特性，即它们在肽侧链全局脱保护反应中的劣质酸不稳定性，以及由此产生的隐含副反应，如磺化。Arg胍侧链的MIS保护基团（图3.25）代表了一个有前途的候选基因。 -与普通的Arg保护基团（例如Pbf和Pmc）相比，MIS表现出急剧升高的酸稳定性。MIS的优点也可以通过其分解模式来体现。Pbf-和Pmc-磺酰基阳离子可以进行不规则的酸解（另见图3.24，位点a）， 分别产生2,2,4,6,7-五甲基呋喃和2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢，这将促进由此产生的磺化副反应。相反，从MIS保护基团的酸解衍生的MIS-OH副产物表现出显著增强的稳定性，并且没有进一步的碎裂和磺化副反应的引发。

在对磺化副反应极度敏感的情况下， -BisBoc保护的Arg衍生物Fmoc-Arg（Boc）（ 另见图3.26）可以作为靶肽产物组装的替代构建单元。 这种 Arg 导数的主要缺点在于由于空间效应不佳，其耦合动力学较差， 但它仍然可以

图 3.26 Fmoc-Arg .完全避免对Trp、Tyr等敏感氨基酸的磺化副反应。

另一方面，清除剂在磺化副反应的程度方面起着至关重要的作用。高效的磺酰基阳离子清除剂可以有效淬灭肽侧链全局脱保护反应过程中释放的磺酰基阳离子，阻断磺酰基阳离子修饰敏感氨基酸残基的途径。在这方面，苯酚在普通的清除剂中脱颖而出（Yang，未发表的结果），水也可以用作磺酰阳离子的淬灭剂。


3.9 过早的 Acm 卵裂 OFF Cys（Acm） 和 Acm

MIGRATION DURING PEPTIDE GLOBAL DEPROTECTION

AcM作为Cys侧链上巯基取代基的保护基的应用极大地促进了含二硫键肽的合成的发展。 AcM作为巯基保护基团引入了一种新的正交性，大大丰富了二硫键化合物的位点选择性制备方法，特别是含有多个二硫键的化合物。

在大多数情况下，Cys侧链上的AcM在酸溶液或碱性溶液中保持稳定，因此可以应用于Boc/Bzl 和Fmoc/ 肽化学。互易的Cys（Acm）对可以释放其Acm保护基团，并在处理 或处理时 通过分子内或分子间二硫键共价连接。或者， 可以使用三氟甲磺酸 银选择性地解封 Acm，并释放相应 Cys 残基上的巯基。目前对强酸性条件下的 稳定性存在相互矛盾的意见。尽管有人断言，Cys侧链上的Acm保护基团在酸或碱介导的 保护基团裂解过程中保持完整，并且TFA或HF溶液中的肽侧链全局去保护，但从HF 或TFA导向 的肽侧链全局去保护可能导致Acm从相应的 中过早裂解的观察结果得出了相反的结论前体，而这种不希望的过程的发生主要取决于在相关的全球脱保护反应中使用的清除剂的组成。

硫代苯甲醚通常作为肽侧链球脱保护的清除剂，可诱导 Cys（Acm） 前体过早地切割 Acm，从而在易感底物（例如 Tyr、Ser 和 Thr 残基）上发生不可逆的 Acm 修饰。众所周知，TFA中的硫代苯甲醚可以通过“推-推机制”促进肽上 -Z保护基团的解封闭;91 而 在不含硫茴香醚的情况下，对 TFA 保持极其稳定。同样，一项相关研究表明 ，在无水TFA处理3-h时， ）不会发生侧链Acm裂解，而在反应体系中加入5%硫代苯甲醚则引起明显

Acm裂解掉相应的 残基。与硫代苯甲醚类似，苯甲醚也可能在肽侧链全局脱保护过程中诱导Acm过早裂解。 鉴于这些观察结果，非常建议使用不含硫茴香醚和硫醇清除剂的 脱保护混合物，或者 在受保护的肽前体中含有残基，以防止在此过程中巯基保护基团意外地过早裂解。

在处理所接触的肽时 ，可以发生Acm基团从 底物Ser/Thr羟基取代基到底物的分子内或分子间迁移。 对于Ser-和/或Thr-丰度肽，这种副反应可能会变得特别严重，从而产生 ）或 ）杂质（另见图3.27）。该副反应的根本原因可归因于该过程中Acm阳离子释放的淬灭不足，以及由此产生的游离Acm阳离子与Ser/Thr侧链上的羟基之间的不可逆功能。不仅Ser/Thr，Asn/Gln也可以进行Acm修饰，并反式形成和 副产物。 考虑到这一副反应，甘油可以作为Acm阳离子底物加入上述过程，以有效抑制Acm 迁移。

与前述副反应类似，含有-Tyr -序列的肽在酸处理时可以适应Acm迁移。Acm 从 Cys 巯基侧链移动到相邻 Tyr 芳香族侧链 的正交位置（图 3.28）。然而，这种明显的 Acm 迁移可以通过干预的 Acm 位移步骤进行，并且衍生的羟基-Acm 中间体通过酸催化的重排转化为最终 的 -Tyr 异构体。 雇用适当的人

图 3.27 介导的 去阻滞期间 的 Acm 迁移。

图 3.28 从 Tyr迁移到邻居的可能机制 。

清除剂可能无法彻底阻止前体 残基中 Acm 的过早裂解，但它仍然可以减弱释放的 Acm 阳离子在底物 Tyr 上的亲电攻击。已经发现，在TFA溶液中添加苯酚可以减少肽侧链全局脱保护过程中产生的 副产物的形成。


3.10 多肽侧过程中的蛋氨酸烷基化反应

CHAIN GLOBAL DEPROTECTION WITH DODT AS SCAVENGER

含Met肽的化学合成的主要问题之一是影响硫醚侧链上硫原子的潜在烷基化副反应。肽侧链全局脱保护步骤中产生的碳正离子会引起Met上硫醚部分的烷基化，并产生各种锍盐侧产物，这些产物随后会发生多样化降解。 与其他亲核氨基酸残基不同，Met可以在广泛的pH光谱内与各种亲电试剂快速发挥作用， 这种独特的特性使Met更容易受到碳正离子和其他亲电试剂的修饰，在TFA介导的肽侧链全局脱保护过程中释放。如果在肽全局脱保护过程中产生的亲电试剂没有被相应的清除剂充分和适当地淬灭，则可能会引起不需要的Met烷基化。

多种硫醇家族清除剂，例如 EDT 和 DTT，由于它们在淬灭在 TFA 介导的肽侧链全局脱保护步骤中释放的亲电衍生物（如叔丁基阳离子）方面具有出色的性能，因此经常用于肽合成。新一代硫醇清除剂替代经典EDT和DTT已经过测试，并开始应用于肽生产。例如，DODT（3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇） 已被用作代替EDT/DTT作为清除剂，这要归功于其无恶臭的特性，在工业肽生产中特别受到赞赏。然而，据报道，利用DODT作为TFA介导的肽侧链全局脱保护的清除剂可能导致形成大量杂质，并且 分子量相对于目标肽产物增加。 通过LC-MS-MS和NMR分析的结合已经证实，所修饰实际上是在受影响肽的Met残基上发生的，副产物被鉴定为叔丁基硫代乙基化锍Met盐

该副反应的假定机理如图3.29.98所示：首先，DODT捕获叔丁基阳离子，从其他受保护的氨基酸残基中释放出来，并转化为相应的 叔丁基化DODT，该DODT发生分子内环化反应，并形成叔丁基硫铵39或二氧六荽衍生物40。活性化合物 的功能或 与硫醚侧链在Met上的功能将导致叔丁基硫基乙基化的Met衍生物41的形成。无论所提出的机制的相关性如何，DODT结构中醚部分的存在似乎是导致这种副反应发生的原因。这

图 3.29 DODT提出的叔丁基硫基乙基化Met的形成机理。在同一研究中，通过用没有以太官能团的 ODT（1,8-辛烷二硫醇）替换 DODT 来验证断言。在其他相同的肽全局脱保护条件下，当ODT用作清除剂时，在DODT存在下基本上形成的分子量增加+117 amu的杂质被彻底抑制。

通过明智地选择硫醇清除剂，或者采用受保护的 元素作为构建单元，可以在单独的步骤中再生Met，可以避免叔丁硫基乙基化Met杂质的意外形成。此外，这种杂质不稳定，可以通过在稀酸性溶液中温和加热来定量脱烷基化以再生原始的Met化合物。


3.11 硫茴香醚诱导的肽副反应


侧链全局去保护


硫代苯甲醚是肽合成中常规使用的清除剂，用于在肽侧链全局脱保护步骤中捕获释放的亲核物质。建议使用硫代苯甲醚作为清除剂，用于许多保护基团的裂解过程，例如苄氧羰基、 Tosyl和 Mtr。 此外，硫代苯甲醚在肽侧链全局脱保护过程中规避不需要的Met氧化的特性也得到了深入开发。

尽管硫茴香醚具有多功能性，但在酸介导的肽侧链全局脱保护过程中，特别是在存在高浓度强酸（如TFMSA或HF）的情况下，硫茴香醚确实可以诱导敏感氨基酸上各种不受控制的修饰，例如Met、Trp、Glu或Asp。 因此，建议避免使用硫代苯甲醚对HF指导的含Trp和Met的肽进行侧链全局脱保护， 或TFMSA，以绕过硫代苯甲醚处理这些残基的烷基化副反应

在第 3.9 节中已经阐明，硫代苯甲醚可能会在肽侧链全局脱保护过程中 和 过程中引起巯基保护基团的过早裂解，这可能能够触发随后的串联副反应。

硫代苯甲醚在肽侧链全局脱保护过程中引发的另一个副反应是不需要 的键裂变。例如 ，甲基酪氨酸可以通过去甲基化途径通过强酸和硫茴香醚的协同作用转化为相应的酪氨酸。这种不希望的过程是由硬酸 使芳醚氧原子（硬碱）质子化而启动的。随后，硫代苯甲醚分子（软碱）的硫原子对缺电子甲基碳（软酸）的亲核攻击导致受害 键的裂解并同时形成新 键（图3.30）。因此，甲基酪氨酸去甲基化过程 是由硫茴香醚和强酸（例如TFMSA）以协同方式诱导的。此过程被视为


图 3.30 硫茴香醚诱导的Tyr（Me）去甲基化


软亲核试剂（硫茴香醚）和硬亲电试剂 通过推拉机制在底物上 产生协同作用。 路易斯酸，如TMSOTf，也可能在硫茴香醚存在下引起去甲基化副反应。该反应的动力学显然与攻击硫亲核试剂的性质相关。硫代苯甲醚在促进去甲基化方面比二甲基硫醚更有效，这要归功于共轭苯基对生成的锍离子 42 的稳定作用。值得注意的是，硫代苯甲醚被认为是肽侧链全局脱保护的可逆清除剂，因为形成的阳离子硫茴香醚加合物可以使肽底物上的亲核官能团重新烷基化。因此，在所反应肽侧链全局脱保护反应中单独使用这种可逆清除剂是不可取的。应同时添加不可逆的清除剂，例如甲酚，以淬灭可能具有反应性的硫代苯甲醚锍阳离子，并防止在此过程中敏感肽官能团的realkylation

将在第 6.5 节中单独详细说明溴乙酰化肽可能会受到 Met 残基上的硫醚侧链引发的分解。同样，出于同样的原因，溴乙酰化肽的全局脱保护过程也可能受到硫代苯甲醚存在的影响。 硫代苯甲醚分子的硫原子对肽溴乙酰基部分的亲核攻击将导致相应的锍肽 42 的形成，该锍肽随后发生各种降解（图 3.31）。

图 3.31 硫代苯甲醚诱导 的溴乙酰化肽降解。

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 第 4 章


肽重排副反应


不希望的肽重排代表了在肽制造和储存过程中发生的一类常见副反应。由于存在过多的官能团和不同的条件，例如，肽在制造过程中必须承受不同的pH值，再加上某种不可预测的协同空间效应，在某些情况下，肽重排很容易发生在一些不稳定的个体上。这些类型的副反应所固有的挑战之一是，衍生的副产物通常是目标肽的异构体，因此，开发与重排肽杂质相关的分析方法是一项关键任务。此外，重排过程还可能导致杂质的形成，其中杂质具有冗余掺入的残基/片段，这些残基/片段难以从目标产物中分离出来。为了减轻这些杂质对肽生产的下游过程（纯化）施加的某种压倒性的压力，应优先在上游过程（合成）中处理它们，以便通过有效的合成策略最大限度地减少这些杂质的发生。在本章中，阐明了阻碍肽合成的代表性重排过程，并讨论了相应的潜在解决方案


4.1 酸催化酰基 迁移及后续肽酸解


酰基在氮原子和氧原子之间的迁移是有机化学中常见的过程，已被许多化合物合成所采用，其中 -酰基异肽合成策略（图1.2）作为突出的例子，在肽制备领域得到了广泛的应用，特别是对于那些具有挑战性的合成，由于肽链沿着受试肽组装体的加速聚集而复杂化。 然而，本章的重点将偏离O-酰基异肽方法的有益方面，而将重点放在与O-酰基异肽构件的利用相互关联的酰基 迁移引起的副反应上，这些副反应与受影响的肽合成过程中的利用有关。

蛋白质自催化降解是指一些含有特定序列的天然蛋白质在某些位点发生断裂，并以这种方式分解成不同的片段的现象。许多蛋白质自催化降解过程是在分子 内酰基迁移化学基础上引发的，并导致形成异构体酯对应物作为中间体。 酰基 迁移过程最初是在强酸处理底物的情况下检测到的，例如， 或 随着Fmoc化学的广泛应用，TFA催化的酰基 迁移正在成为肽合成中最常检测到的副反应之一。 这种副反应可能是在酸介导的肽侧链全局脱保护步骤中诱导的，其严重程度显然与亲本肽的特定序列相关。例如，在所接触的肽序列中，仅用其D-氨基酸对应物替换残基可能会大大影响该副反应的趋势。 此外，肽序列中磷酸氨基酸的存在也可能显著促进酰基 迁移，其程度可能取决于所指的磷酸氨基酸残基在肽序列中的特定位置。 肽合成中酸催化酰基位移的受体通常是那些带有亲核取代基的残基，例如 Ser、Thr 或 Cys，而该领域将专门关注 酰基迁移。

酸催化酰基 迁移的机理如图4.1所示。肽的Ser或Thr上的羟基在其前一个主链酰胺键上 引发酸催化的亲核攻击，并生成一个5元环羟基恶唑烷中间体 ，后者随后在酸性条件下重排为相应的酯异构体 。也有人断言，浓缩 催化的酰基 迁移是通过噁唑啉中间体进行的。酸催化的酰基 迁移是一个可逆的过程，在中性或碱性条件下可以重定向到酰胺的形成。在酸性环境中，肽 上释放的氨基的质子化是驱动酯形成方向平衡的关键动力。在中性或碱性情况下，酯 将发生迅速的酰基 转移以再生原始酰胺

或

图4.1 酸催化肽酰基 迁移的机理。

复合。 这种平衡被认为是O-酰基异肽构建单元在肽合成中应用的理论基础。

酰基 迁移可能发生在肽侧链全局脱保护的步骤中。如图 4.2 所示，受侧链保护基裂解过程影响的普通肽 4 可能会受到 -Xaa-Ser/Thr- 序列位点伴随的酰基 迁移的影响，并被重新排列为相应的异构体酯 5。后者在合成、后处理、分离、纯化甚至储存过程中可能在水溶液条件下发生水解降解，并被分解为所得肽片段6和

基本上，酰基 迁移过程比内丝氨酸残基更频繁地影响 -末端 Ser 底物。 以 具有 -AcSer部分的肽为例（图4.3），从 -Fmoc保护的前体再生的 -基团进行乙酸介导的乙酰化过程，衍生 的-Ac-Ser肽随后受到TFA指示的肽侧链全局脱保护。在这种情况下，相关肽8上的N-末端 -Ac-Ser部分将部分发生TFA催化的酰基 迁移，从而产生异构体 杂质9。如果

图 4.2 含有 -Xaa-Ser/Thr- 单元的肽的酸解。

图4.3 酰基在-Ac-Ser肽上的 迁移和随后的去乙酰化过程。酯衍生物 在酸性环境中会进一步水解降解，侧链乙酰化中间体可以转化为相应的脱乙酰化副产物10。总体而言，降解结果可被视为 -脱乙酰化的结果。然而，所描述的酰基 迁移效应可能有助于这种分解过程。

应注意这些酰基易迁移肽产物的合成：（1）应尽量避免使用强酸，如HCl 和TFMSA;（2）如果在肽全局脱保护中不能保留强酸，则应防止添加水作为清除剂或助溶剂;（3）降低酸浓度，去除侧链保护基团;（4）酰基 迁移的程度与所试肽的酸处理持续时间直接相关。 因此，合理缩短酸胁迫对敏感肽的酸胁迫可以有效减少酰基 迁移诱导的不良肽酯形成。可以相应地缓解随后可能发生的肽酯水解，以及由此产生的骨架碎裂;（5）在产品净化和贮存过程中应慎重。从含有洗脱液酸性添加剂的RP-HPLC中收集的产品馏分应尽快进行冻干，以减少可能的酸催化酰基 迁移;或者，在后续处理之前中和产品馏分;（6）在发生酰基 迁移的情况下，目标产物的再生可以通过用易于去除的碱基处理来实现，例如，稀氨溶液，以逆转酰基 迁移的平衡到酰胺形成的方向。


4.2 碱催化酰基 迁移


碱基催化的酰基 迁移可看作是酸催化的酰基 迁移的逆反应。在肽合成中广泛应用的邻酰基异肽策略利用了酰基 迁移在碱性条件下的固有特性，从而从其相应的酯前体中再生目标酰胺产物（通过这种方法规避了肽组装过程中某些步骤的困难偶联）。

本节的内容将重点介绍肽合成中副反应的行为。所提出的酰基 迁移过程机理如图4.4所示。 带有酯部分的肽在 碱基的促进下受到相关酯键的亲核攻击，并因此形成 5 元环羟基恶唑烷中间体 12，该中间体 12 因此发生开环并转化为相应的酰胺异构体 13。

碱催化的肽合成酰基 迁移可作为三氟乙酸副产物形成的来源。在Boc模式下

或

图4.4 碱基催化肽酰基 迁移的机制。

图 4.5 -N -末端 Ser/Thr 肽上的三氟乙酰化副反应。

用于 去除-Boc的SPPS TFA可能与树脂上残留的未酰化羟基一起发挥作用，形成的三氟乙酰衍生物可能会在中和步骤的后续碱处理中引起酰基 迁移。在这种情况下，所受的三氟乙酰基将从羟基转移到肽骨架 上，并形成 -三氟乙酰基肽副产物，从而导致肽链伸长的终止。 类似地，在合成N端Ser或Thr肽的过程中，所述Ser/Thr上释放的羟基侧链可以在肽侧链全局脱保护的步骤中被TFA（或可能的残留三氟乙酸酐）官能化，从而形成相应的H-Ser/Thr（TFA）衍生物14。该中间体随后可能在后处理或纯化过程中发生三氟乙酰 基位移，生成 -三氟乙酰化副产物 （图4.5）。

由于不需要的碱催化酰基 迁移，在根据原始合成策略制备环状衍生物18的过程中形成了丰富的异构酰胺杂质19（图4.6）。 首先对树脂上线性前体肽16进行处理 ，以分别从原始连接的D-Asp-C 和D-Ala- 中去除Ally和Alloc保护基团。释放的羧基和氨基随后通过PyBOP介导的偶联通过新形成的酰胺键共价剪接，从而形成环状中间体17。随后进行的 哌啶处理是为了使Fmoc保护基团 脱离阻断，从而提供受保护的环肽18。原文

图 4.6 环肽制备中的酰基 迁移副反应 18.

该处理的目的是 在下一步中将释放的 Thr 酰化，以组装目标产物。然而，中间体 在哌啶处理后遭受了不希望的酰基 迁移。Thr 羟基侧链和 D-Ala 羧酸酯主链之间原来不稳定的酯键承受了亲核攻击， 并被所指的 Thr 和 D-Ala之间新形成的酰胺键所取代。因此，副产物19是在碱催化的酰基 迁移的基础上引发的。因此，开发了一种消除这种副反应的解决方案，其中采用Trt而不是Fmoc作为相关Thr的 保护基团。由于 -Trt可以通过稀酸溶液解封，因此专门解决了酰基 相对于碱催化剂迁移的根本原因，并有效地防止了最终产物中酰胺到酯的不希望的异构化。

多肽合成采用“最小保护”策略，其中Ser/Thr残基以侧链的形式组装到目标肽链中，未受保护的衍生物可能本质地纠缠在碱催化的酰基 迁移副反应中。例如，采用“全局磷酸化”策略（图4.7）的磷酸化Ser Thr肽的化学合成可能会引起碱基催化的酰基 迁移和一系列由此产生的副反应。Ser/Thr 残基以侧链未受保护的物种的形式掺入靶前体肽 20 中。当线性肽的组装完成后，进行“全局磷酸化”，其中 Ser/Thr 上的游离 羟基被转化为相应的磷酸化 Ser/Thr 对应物，从而产生靶磷酸肽 21。

根据“全局磷酸化”策略，具有游离 羟基的 Ser/Thr 残基应该被掺入待磷酸化的肽前体中。然而，在此过程中容易发生副反应，例如，所处理的 Ser/Thr 残基的冗余掺入以及由此产生的过度磷酸化。上述副反应的根本原因是