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慧 眾 生 物 科 技 有 限 公 司

EasyPure

質粒DNA微量製備試劑盒

故障排除

樣品名稱：

1-4 ml細菌培養物

產量：

高達30 ug質粒/粘粒DNA

格式：

旋轉柱

操作時間：20 min洗脫體積：50-100 ul儲存條件：

在室溫（15- 25 ℃）下。

問題

可能的原因/解決方案

低產

細菌細胞未完全裂解

* 使用了太多的細菌細胞。如果使用超過10 A單位的細菌培養物，則將其分離到多個試管中。* 加入PD 3緩衝液後，通過倒置使沉澱物破碎，以確保更高的產率。

DNA洗脫步驟不正確

* 確保加入洗脫緩衝液並吸收到旋轉柱基質的中心

DNA洗脫不完全

如果質粒DNA大於10 kb，則在洗脫步驟中使用預熱洗脫緩衝液（60-70 ℃）以提高洗脫效率。

清洗緩衝液不正確

檢查以確保在使用前已將乙醇添加到清洗器中。

洗脫的DNA

表現不佳

下游

應用

殘留乙醇污染

* 在洗滌步驟後，乾燥旋轉柱，同時以最高速度額外離心5分鐘或在60 ℃下孵育5分鐘。

RNA污染

* 在使用PD1緩衝液之前，檢查是否添加了RNase A。如果添加RNA酶A的PD1緩衝液過期，則添加額外的RNA酶A。

* 使用太多細菌細胞，減少樣品體積。

基因組DNA污染

* 請勿使用過度生長的細菌培養物。

* 在PD2和PD3緩衝液添加期間，輕輕混合以防止基因組DNA剪切。

核酸酶污染

如果宿主細胞具有高核酸酶活性（例如，endA+菌株），進行該可選清洗步驟以去除殘留的核酸酶。

以6000xg（8，000rpm）的轉速旋轉30秒。

從標準清洗步驟繼續。

僅供研究使用。

不用於診斷或治療程式

* 首次使用前，向清洗緩衝液中加入100 ml乙醇（96-100%）。** 在首次使用前，向洗滌緩衝液中加入160 ml乙醇（96-100%）。

將提供的RNA酶A加入PD 1緩衝液中並在4 ℃下儲存。

如果在PD 2緩衝液中形成沉澱，則在37 ℃水浴中加熱緩衝液以溶解。PD 3緩衝液含有鹽酸胍，這是有害的和刺激性的。在操作過程中，始終穿戴實驗服、一次性手套和護目鏡。

目錄號PM100 100 mini preps / kit PD 1緩衝液：25 ml PD 2緩衝液：25 ml PD 3緩衝液：40 ml W1緩衝液：50 ml洗滌緩衝液（濃縮）：25 ml * 洗脫緩衝液：6 ml

RNase A（50 mg/ml）：50 μ l 2 ml收集管：100 pcs PD柱：100 pcs

目錄號PM 300 300 mini preps / kit PD 1緩衝液：65 ml PD 2緩衝液：75 ml PD 3緩衝液：100 ml W1緩衝液：130 ml洗滌緩衝液（濃縮）：40 ml ** 洗脫緩衝液：30 ml

RNase A（50 mg/ml）：130 μ l 2 ml收集管：300 pcs PD柱：300 pcs

高拷貝數方案

收穫1.將1.5 ml細菌培養物轉移至微量離心管（未提供）中。

2.在微量離心機中以全速（13，000 rpm）離心1 min，棄去上清液。(If如果使用的細菌培養物超過1.5 ml，則重複收穫步驟。對於超過4 ml，使用多個色譜柱。）重懸3.加入200 μ l PD 1緩衝液（加入RNA酶A），通過渦旋或移液使細胞沉澱重懸。裂解4.加入200 ul PD 2緩衝液，並通過倒置試管10次輕輕混合。不要渦旋，避免剪切基因組DNA。

5.使混合物在室溫下靜置2分鐘，直至裂解物澄清。中和6.加入300 μ l PD 3緩衝液，並立即將試管倒置10次混合。請勿渦旋。

7.全速攪拌2分鐘。dna結合

8.將PD色譜柱置於2 ml收集管中。

9.將步驟7中的澄清裂解物（上清液）應用於PD色譜柱。

10.全速前進30秒。

11.棄去流通液，將PD色譜柱放回2 ml收集管中。洗

12.在PD柱中加入400 ul W1緩衝液。

13.全速前進30秒。

14.棄去流出液，並將PD柱放回2ml收集管中。

15.向PD柱中加入600 μ l洗滌緩衝液（加入乙醇）。

16.全速前進30秒。

17.棄去流出液，並將PD柱放回2 ml收集管中。

18.再次全速沖洗3 min，使色譜柱基質乾燥。

低拷貝數方案根據組分說明將乙醇和RNA酶A加入緩衝液中。

當從LB培養基中過夜細菌培養物製備低拷貝數質粒時，典型的產量為約0.5 - 1.0 μ g/1 ml培養物。

收穫1.通過離心收穫ep至10 ml過夜培養物。重懸2.加入400 μ l PD 1緩衝液（加入RNA酶A），通過渦旋或移液使細胞沉澱重懸。裂解3.加入400 μ l PD 2緩衝液，倒置試管10次，輕輕混合。不要渦旋，避免剪切基因組DNA。

4.使混合物在室溫下靜置2分鐘，直至裂解物澄清。第五章.加入600 μ l PD 3緩衝液，並通過倒置試管10次立即混合。請勿渦旋。

6.全速攪拌2分鐘。7.將PD色譜柱置於2ml收集管中。

8.將750 ul來自步驟6的澄清裂解物（上清液）上樣至PD柱。

9.以10，000xg（13，000rpm）的轉速旋轉30秒。棄去流出液，並將PD柱放回2ml收集管中。

10.將剩餘的澄清裂解物上樣至相同的PD色譜柱。

11.以10，000xg（13，000rpm）的轉速旋轉30秒。

12.棄去流出液，並將PD柱放回2ml收集管中。

13.在PD柱中加入400 ul W1緩衝液。

14.以10，000xg（13，000rpm）的轉速旋轉30秒。

15.棄去流出液，並將PD柱放回2ml收集管中。

16.向PD柱中加入600 μ l洗滌緩衝液（加入乙醇）。

17.以10，000 xg（13，000 rpm）轉速旋轉30秒。

18.棄去流出液，並將PD柱放回2 ml收集管中。

19.再次全速攪拌2 min，使色譜柱基質乾燥。20.第二十三章將乾燥的PD柱轉移到乾淨的1.5 ml微量離心管（未提供）中。

21.將50 ul洗脫緩衝液或ddH 2 O（pH 8.0-8.5）直接添加到膜中心。如果質粒DNA大於10 kb，則在洗脫步驟中使用預熱洗脫緩衝液（60-70 ℃）以提高洗脫效率。

21.靜置2分鐘，直至液體被基質吸收。

22.以全速電泳2分鐘以純化DNA。

19.第十九章將乾燥的PD色譜柱轉移至乾淨的1.5 ml微量離心管（未提供）中。

20.將50 μ l洗脫緩衝液或ddH 2 O（pH 8.0-8.5）直接加入膜中心。避免殘留緩衝液粘附在色譜柱壁上。

21.靜置2分鐘，直至液體被吸收。22.以全速電泳2分鐘以純化DNA。