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doi:10.1038/nature18928
中风后星形胶质细胞向神经元转移线粒体
早川和秀、埃尔加-埃斯波西托、王晓华、寺崎泰和、刘毅、邢长虹、纪勋明和罗英豪
神经元可以释放受损的线粒体，并将其转移到星形胶质细胞中进行处理和再循环。这种交换线粒体的能力可能是中枢神经系统中细胞间信号传递的一种潜在模式。在这里，我们发现小鼠的星形胶质细胞也能释放功能线粒体进入神经元。星形胶质细胞释放细胞外线粒体颗粒是由 CD38 和环 ADP 核糖信号的钙依赖机制介导的。小鼠短暂的局灶性脑缺血诱导星形胶质细胞线粒体进入邻近的神经元，这种进入放大了细胞存活信号。通过短干扰 RNA 抑制 CD38 信号减少了细胞外线粒体的转移，并恶化了神经系统的预后。这些研究结果表明，神经胶质细胞串扰的线粒体新机制可能有助于中风后的内源性神经保护和神经恢复机制。
星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着广泛的作用，参与神经发育、神经传导、脑代谢和血流的调节。正常的星形胶质细胞能保护神经元免受氧化应激和兴奋毒性的伤害。相反，不健康的星形胶质细胞会释放有害因子，损害神经元。健康的线粒体可能对这些神经胶质细胞保护机制至关重要，因为抑制星形胶质细胞的线粒体会使神经元容易发生细胞死亡。线粒体是细胞内能量和活力的核心，但在某些情况下，线粒体也可能被释放到细胞外空间。例如，视网膜神经元可能会将线粒体转移到星形胶质细胞中进行处置和再循环，骨髓基质细胞可能会将线粒体转移到肺泡中以抑制急性肺损伤。
在此，我们研究了星形胶质细胞能否产生功能性细胞外线粒体，以支持缺血性中风后神经元的存活。电子显微镜证实，大鼠皮质星形胶质细胞的条件培养基中存在含有线粒体的细胞外颗粒（图 1a，扩展数据图 1a）。qNano 分析显示，通过荧光激活细胞分拣（FACS）分离的星形胶质细胞衍生线粒体颗粒大小范围从 300 纳米到 1,100 纳米不等（扩展数据图 1b-d），其中包括β1-整合素（79%）和 CD63（43%）阳性的群体（扩展数据图 2）。MitoTracker 标记表明，这些细胞外线粒体可能仍有功能（图 1b），通过 0.2-μm 过滤器过滤星形胶质细胞衍生的条件培养基会耗尽功能线粒体的数量，并降低线粒体 ATP、膜电位和耗氧量的测量值（图 1b-e）。
一个重要的问题是，细胞外线粒体是代表主动信号还是仅仅是细胞碎片。为了解决这个问题，我们研究了受刺激的星形胶质细胞是否会主动产生细胞外线粒体。CD38 催化线粒体膜上钙信使环状 ADP-核糖（cADPR）的合成。在大脑中，CD38 主要在胶质细胞中表达、
由于星形胶质细胞在神经元释放谷氨酸时会增加 CD38 的表达，因此它可能在神经胶质细胞串扰中发挥作用。根据这些背景文献以及大多数活跃分泌的细胞事件涉及钙调节的事实，我们决定评估 CD38-cADPR-calcium 信号作为星形胶质细胞产生细胞外线粒体的候选机制。首先，我们确认大鼠皮质星形胶质细胞表达 CD38 蛋白，并含有 CD38 或 ADPR 环化酶活性（图 1f、g）。然后，我们用两种方法改变了这一途径。当使用 CRISPR/Cas9 激活质粒上调星形胶质细胞 CD38 时，条件培养基中细胞外线粒体的功能终点显著增加（图 1h-k）。当星形胶质细胞受到 cADPR 刺激以激活 CD38 信号时，细胞外线粒体在条件培养基中增加，同时功能终点也以钙依赖的方式增强（图 1l-n，扩展数据图 3）。cADPR 的刺激似乎不会损害星形胶质细胞的活力（图 1o），这表明细胞外线粒体的释放并非由于非特异性细胞毒性。
如果星形胶质细胞能产生功能性细胞外线粒体，这些信号就有可能影响邻近的神经元。当大鼠皮质神经元受到氧气-葡萄糖剥夺时，细胞内 ATP 水平下降，神经元活力降低，正如预期的那样（图 2a-c，扩展数据图 4a）。当向神经元添加含有细胞外线粒体颗粒的星形胶质细胞条件培养基时，ATP 水平升高，神经元活力恢复（图 2a-c，扩展数据图 4a）。然而，当从星形胶质细胞条件培养基中移除细胞外线粒体时，神经保护作用不再出现（图 2a-c，扩展资料图 4a）。基于免疫染色的细胞计数也得到了类似的结果（图 2d）。作为对照，ATP-脂质体没有明显的保护作用（图 2e），这表明星形胶质细胞线粒体进入神经元可能产生 ATP 能量本身之外的额外益处。荧光显微镜证实星形胶质细胞衍生的线粒体存在于处理过的神经元中（图 2f 和扩展数据图 4b）。
除了预防急性神经元死亡外，延迟神经可塑性对中风预后也很重要。CD38 对大脑可塑性可能很重要，因为 CD38 缺失的小鼠在脑损伤后的恢复情况会恶化，而且 CD38 突变可能是行为功能障碍的危险因素。因此，我们想知道 CD38 介导的星形胶质细胞到神经元线粒体转移是否也会影响神经可塑性。我们用含有绿色荧光蛋白（GFP）的构建体CellLight Mitochondria-GFP标记神经元，用红色荧光探针MitoTracker Red CMXRos分别标记星形胶质细胞，并将两种细胞共培养24小时。共聚焦显微镜显示，在体节和轴突内检测到了来源于星形胶质细胞的线粒体（图 3a），在这些共培养条件下，星形胶质细胞以 CD38 依赖性方式支持血清/葡萄糖饥饿后神经元的存活（扩展数据图 5）。当星形胶质细胞线粒体
1 美国马萨诸塞州查尔斯顿，马萨诸塞州 02129，麻省总医院和哈佛医学院放射科和神经科神经保护研究实验室。
2 首都医科大学宣武医院脑血管病研究中心，中国北京 100053。
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(4)
(4) (4) (4)
–
+
–
–
+
+
–
–
OGD/reoxy
神经元
ACM
mdACM
+
+
+
–
+
+
–
+
(4) (4) (4) (4)
–
+
–
–
+
+
–
–
OGD/reoxy
空
脂质体
1
10100
1,000
神经元
ACM
mdACM
+
+
+
–
+
+
–
+
P < 0.05 P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
b
c
NeuN
+/MAP
+
cell
每 0.25 毫米
2
(4)
(4)
(4)
(4)
–
+
–
–
+
+
–
–
OGD/reoxy
神经元
ACM
mdACM
+
+
+
–
+
+
–
+
NeuN MAP2 DAPI
控制
OGD
OGD
OGD
+ACM
+mdACM
d
(4)
(4)
(4)
(4)
ATP 脂质体（nM）
(4)
e
神经元
2 h OGD
18 h
ACM
or
mdACM
细胞内 ATP 细胞活力（WST） MAP2/NeuN 计数
a
f
星形细胞
线粒体
亮场
合并
细胞活力 (%)
细胞内 ATP（比率）
细胞活力 (%)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
50
60
70
80
90
100
0
20
40
60
80
100
50
60
70
80
90
100
图 2：星形胶质细胞细胞外线粒体与神经保护。
a. 测试 ACM 或 mdACM 对大鼠皮质神经元氧-葡萄糖剥夺（OGD）的神经保护作用的实验示意图。b, ACM 而非 mdACM 可挽救受损神经元中的 ATP 水平（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。c, ACM 而非 mdACM 可恢复 OGD 后的神经元活力（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。 d, 免疫染色证实了 ACM 而非 mdACM 的神经保护作用（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。NeuN 和 MAP2 是神经元标记物。e, OGD 后脂质体 ATP（1-1,000 nM）的神经保护作用无统计学意义。 f, 荧光显微镜显示神经元内存在星形胶质细胞线粒体（用 MitoTracker Red CMXRos 标记，200 nM）。比例尺为 100 μm。数据为平均值 ± s.e.m.，P 值来自单因素方差分析和 Tukey 检验。
细胞外
线粒体（%）
m
n
o
(7)
(7)
JC1（绿/红）
O
2
消耗
cADPR (μM)
(4)
(4)
(4)
(4)
细胞活力 (%)
时间（分钟）
l
SSC
cADPR
控制
cADPR
控制
cADPR
控制
线粒体
a
500 纳米
线粒体
P < 0.01
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
(4)
(4)
c
e
d
(4)
(4)
CD38
星形胶质细胞神经元
GFAP
β-肌动蛋白
MAP2
f
细胞外 ATP
（比率）
JC1（绿/红）
O
2
消耗
时间（分钟）
b
线粒体
SSC4.2%
36.5%
ACM
mdACM
P < 0.01
P < 0.01
g
h
k
对照质粒 (5)
大鼠皮质
星形胶质细胞（~80）
ATP/O
消耗
转染
24 小时 CD38 环化酶活性
+NAD
24 h
i
j
CD38/ADPR 环化酶活性
CD38/ADPR 环化酶活性
细胞外 ATP（比率）
O
2
消耗
对照质粒 (5) CD38 激活质粒 (5)
时间（分钟）
时间（分钟）
CD38 激活质粒 (5)
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
为 3
6
9
1.0
1.1
1.2
ACM (9)
ACM
mdACM (6)
mdACM
ACM
mdACM
0
5
15 45 60
0
1
2
3
4
5
神经元 (8)
星形胶质细胞 (5)
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
4
P re1.5
4.56.0
9.0
3.0
7.5
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
(3)
(3)
0
20
40
60
80
100
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Pre
3
6
9
1215
18
0
0.010.1
1
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
1.25
cADPR (4)
控制 (4)
0
50
100
150
图 1：星形胶质细胞 CD38 和细胞外线粒体。
a、星形胶质细胞条件培养基（ACM）中细胞外线粒体的透射电子显微镜（TEM）。刻度线，500 nm。
b，用 MitoTracker Red CMXRos 标记大鼠皮质星形胶质细胞。FACS 显示，通过 0.2-μm 过滤器过滤会耗尽 ACM 中细胞外线粒体的水平（线粒体耗尽的 ACM；mdACM）。2-μm 过滤器降低了 ACM 中细胞外线粒体功能的几个标记：细胞外 ATP（c，n = 4 个独立实验）、膜电位（JC1 比率；d，n = 4 个独立实验）和耗氧量（e，n = 3 个生物重复，n = 9 或 6 个独立实验）。g，星形胶质细胞和神经元中 CD38 环化酶活性的高低（n = 2 个生物重复，n = 8 或 5 个独立实验）。
活化。NAD，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐（200 μM）。i，转染 24 小时后，CD38 激活质粒上调 CD38 环化酶活性（n = 2 个生物重复，n = 5 个独立实验）。j，k，CD38 激活显著增加细胞外 ATP 生成（j）和耗氧量（k）（n = 2 个生物重复，n = 5 个独立实验）。l，FACS 显示星形胶质细胞中细胞外线粒体受 cADPR（1 μ M）刺激增加（n = 3 个独立实验）。m，cADPR（1 μ M）增加了 24 小时细胞外线粒体膜电位（n = 2 个生物重复，n = 7 个独立实验）。n，cADPR 增加了细胞外线粒体的耗氧量（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。 o，cADPR 不会导致星形胶质细胞中毒（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。数据为平均值 ± s.e.m。P 值来自非配对 t 检验（c、d、i、j、l、m）或双方差分析（ANOVA）（e、k、n）。
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通过抑制线粒体丙酮酸酶使星形胶质细胞功能失调，cADPR 刺激的星形胶质细胞不再支持神经元存活和轴突延伸（扩展数据图 6）。为了进一步评估我们的假设，我们询问星形胶质细胞转移线粒体的能力是否会在病理条件下增强神经可塑性。对照组或 CD38 沉默的星形胶质细胞在氧气-葡萄糖剥夺后与存活的神经元共同培养（图 3b）。短干扰 RNA（siRNA）抑制星形胶质细胞中的 CD38 可减少线粒体转移（图 3c）和损伤后的树突再生（图 3d）。
综上所述，这些细胞研究结果似乎与 CD38 信号可帮助星形胶质细胞将线粒体转移到神经元并促进损伤后的存活和可塑性这一总体假设相一致。但目前还不清楚这种机制是否在体内起作用。为了解决这个问题，我们转而研究小鼠局灶性脑缺血模型。首先，用 MitoTracker Red CMXRos 标记原始小鼠皮质星形胶质细胞培养物，并收集细胞外线粒体颗粒。然后对小鼠进行局灶性脑缺血，3 天后将细胞外线粒体颗粒直接注入梗死周围皮层。24 小时后，免疫染色显示移植的星形胶质细胞线粒体存在于神经元中（图 3e）。接下来，我们转向 FVB/N-Tg (GFAPGFP)14Mes/J转基因小鼠。
当这些小鼠遭受局灶性脑缺血时，中风后 24 小时，邻近神经元内出现荧光线粒体颗粒信号（图 3f）。通过流式细胞术从缺血性梗死周围皮层收集的神经元显示，细胞存活相关信号（如磷酸化 AKT 和 BCL-XL）普遍上调，线粒体标记物 TOM40 也有所增加（图 3g，扩展数据图 7）。
最后，我们尝试了功能缺失实验，以确定阻断 CD38 信号是否会导致中风后预后恶化。在我们的局灶性脑缺血小鼠模型中，CD38 在梗死周围皮质中上调（扩展数据图 8a）。中风后 5 天，将 Cd38 siRNA 或对照 siRNA 注入脑室（图 4a）。注射 siRNA 2 天后，梗死周围皮层 CD38 总表达成功下调（扩展资料图 8b）。梗死面积或 GFAP 阳性反应性星形胶质细胞的总水平没有明显差异（图 4b、c），但表达 CD38 的星形胶质细胞亚群明显减少，而其他表达 CD38 的细胞，如 CD8 T 细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的数量没有受到影响（图 4c，扩展资料图 8c-g）。为了评估该体内模型中细胞外线粒体颗粒的水平，使用流式细胞术分析了脑脊液（CSF）。在 CSF 中检测到了 GFAP 阳性线粒体，注射 Cd38 siRNA 似乎减少了线粒体的数量。
MAP2 星形胶质细胞线粒体 DNA
50 μm
i
ii
i
ii
e
pAKT
MAP2
+/GFP
–
MAP2
+/GFP
+
BCL-XL
TOM40
活跃
caspase 3
AIF
g
YZ
XZ
pAKT
BCL-XL
活性 caspase 3
AIF
TOM40
蛋白质表达
(GFP /GFP)
神经元
2 h OGD
48 h
线粒体转移 树突延伸
18 h
线粒体标记的星形胶质细胞
(54)
(41)
P < 0.01
siRNA 对照
Cd38 siRNA
星形胶质细胞线粒体
MAP2
a
c
OGD/reoxy
神经元
星形胶质细胞
对照 siRNA
Cd38 siRNA
(5) (6) (5) (6)
–
+
–
–
–
+
+
–
–
–
+
+
+
+
–
+
+
+
–
+
P < 0.01
P < 0.05
控制
OGD
OGD
OGD
只有神经元
+ 星形胶质细胞
(siRNA 对照）
+ 星形胶质细胞
(Cd38 siRNA）
MAP2 跟踪
MAP2 跟踪
d
(54)
(41)
1
2
3
1
2
3
100
μm
b
MAP2 星形胶质细胞线粒体 神经元线粒体
树突的相对长度
索玛尺寸 (
μ
m
2)
神话密度/
soma
f
50 μm
GFP TOM40 MAP2
同侧
50
μm
对侧
注射
25
50
75
100
125
150
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Cd38
siRNA
siRNA 对照
Cd38
siRNA
siRNA 对照
0
30
60
90
120
150
0.01
0.1
1
10
100
β-肌动蛋白
图 3：缺血后星形胶质细胞线粒体与神经可塑性
a，共聚焦显微镜显示星形胶质细胞线粒体（红色，MitoTracker Red CMXRos）可能转移到神经体节（1）和轴突（2），部分可能与神经元线粒体融合（3；绿色，CellLight Mitochondria-GFP）。 b，共培养研究的实验示意图。c、当星形胶质细胞中的 CD38 被抑制时，神经元体节大小不变，但神经元体节中的星形胶质细胞线粒体密度明显降低（n = 54 或 41 个体节，来自 n = 2 个生物重复，n = 3 个独立实验计数）。d，树突延伸的定量（MAP2 染色）（n = 2 个生物重复，n = 5 或 6 个独立实验）。 e，雄性 C57BL/6 J 小鼠接受 60 分钟瞬时局灶性缺血。三天后，将星形胶质细胞线粒体颗粒（每 2 μl 含 1,000 个颗粒，MitoTracker Red CMXRos）注入大脑皮层。Z-stack
f, FVB/N-Tg (GFAPGFP)14Mes/J转基因小鼠的荧光标记星形胶质细胞受到 30 分钟的瞬时局灶性缺血。g, Western 印迹表明，GFP 阳性神经元上调细胞存活相关蛋白（磷酸化-AKT、BCL-XL），但不上调凋亡相关蛋白（caspase 3、AIF），同时线粒体 TOM40 增加（n = 3 只小鼠）。离体神经元表达成熟（神经丝）而非神经干细胞标记（nestin）（见扩展数据图 7f）。数据为平均值 ± s.e.m。P 值来自非配对 t 检验 (c) 或单向方差分析，然后进行 Tukey's 检验 (d)。
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图 4d）。与此同时，流式细胞术被用来量化 MAP2 神经元线粒体的水平（扩展数据图 9）。用 Cd38 siRNA 处理的大脑显示神经元线粒体显著减少（图 4e），这表明干扰 CD38 信号可能抑制了内源性星形胶质细胞到神经元的线粒体转移。伴随这些影响的是梗死周围 GAP43（神经可塑性的替代标记物；图 4f、g）的减少和神经功能的恶化（图 4h、i）。此外，抑制 CD38 还会明显降低 CSF 细胞外线粒体颗粒的耗氧量测量值（图 4j），而神经功能预后似乎与这些功能终点呈负相关（图 4k、l），这表明 CSF 线粒体功能可能是中风后神经胶质细胞信号传导的潜在生物标记物。
总之，这些发现表明星形胶质细胞可能通过 CD38 介导的机制释放细胞外线粒体颗粒，这些颗粒在中风后进入神经元（图 4m）。然而，这些概念验证结果的详细机制和可推广性还有待进一步研究。首先，细胞外线粒体释放和进入神经元的动态以及功能获益的定量阈值仍有待完全确定（扩展数据图 10a-i）。第二个注意事项与线粒体进入机制有关。在神经元中，内吞可能受 dynamin/clathrin 或整合素途径的调节。在我们的模型中，整合素介导的 Src/Syk 信号可能参与其中（扩展数据图 10j-m）
在不同的疾病条件下，整合素介导的线粒体转移是如何调节的，还需要进一步研究。第三，CD38 也在免疫细胞中表达。在本研究中，体内 siRNA 抑制 CD38 似乎不会影响 T 细胞或小胶质细胞/巨噬细胞，但应仔细考虑星形胶质细胞中可能有益的 CD38 信号与免疫细胞中有害的 CD38 信号之间的平衡。第四个注意事项是其他神经胶质细胞是否可能参与其中。小胶质细胞、少突胶质细胞和周细胞在中风后被激活，因此它们在线粒体交换中的潜在作用值得进一步研究。最后，星形胶质细胞可产生许多保护和恢复神经元的因子，包括 tPA、高迁移率基团框 1（HMGB1）、含有 VEGF 和 FGF-2 的细胞外微囊泡以及各种 microRNA。线粒体颗粒如何与这些其他细胞外信号相互作用，值得探讨。
非细胞自主信号对于中枢神经系统的伤后或病后恢复至关重要。本研究表明，在脑缺血的情况下，星形胶质细胞可能会释放细胞外线粒体颗粒，进入神经元支持细胞活力和中风后的恢复。
在线内容方法，以及任何附加的扩展数据显示项目和源数据，可在在线版论文中获取；这些部分的独特参考文献仅在在线版论文中出现。
2016年1月11日收到；6月14日接受。
1.
Davis, C. H. 等人. 轴突线粒体的跨细胞降解。Proc.Natl Acad.USA 111, 9633-9638 (2014)。
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3.
Attwell, D. 等人. 神经胶质细胞和神经元对脑血流的控制。自然》468 卷，232-243 页（2010 年）。
l
脚部故障 (%)
脚部故障 (%)
神经核心
CSF
O
2
消耗
O
2
消耗
O
2
消耗
时间（分钟）
C
I
C
I
C
I
C
I
siRNA 对照 (5)
Cd38 siRNA (5)
GAP43/
β
-肌动蛋白
CD38 cADPR
Ca
线粒体的释放和转移
生存与可塑性
GFAP
皮质干细胞皮质干细胞
皮质
纹状体
皮质
纹状体
米特跟踪器（CMXRos）
2.7
siRNA 对照
Cd38
siRNA
17
0.2
80
0.1
0.02
14
85
(6)
(6)
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.01
P < 0.01
P < 0.001
P < 0.05
(6)
(6)
线粒体总数 (%)
GFAP
+ 线粒体 (%)
d
g
β-肌动蛋白
GAP43
C
I
控制
siRNA
CD38
siRNA
C
I
C
I
C
I
(9)
(7)
i
#
*
k
m
神经核心
第三天
第七天
总步长/2 毫米
siRNA 对照 (7)
Cd38 siRNA (9)
j
h
siRNA 对照 (7)
Cd38 siRNA (9)
(9)
(7)
(8)
(10)
NS
NS
Cd38 siRNA
siRNA 对照
a
b
siRNA
MCAO
第 0 天
1
2
3
4
5
6
7
梗塞面积 (%)
siRNA 对照
Cd38
siRNA
GFAP CD38
100 μm
100 μm
c
e
f
e
(8)
(5)
Mito
high
MAP2 (%)
MAP2
siRNA 对照
Cd38
siRNA
34.1
1.2
5.1
45.8
0.6
5.6 TOM40
48.0
19.0%
59.5
34.6%
梗死周围皮层
GAP43
Cd38
siRNA
siRNA 对照
0
20
40
60
80
0
10
20
30
0
1
2
3
4
5
0
10
20
30
40
50
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0
2
4
6
8
0
50
100
150
200
250
0
10
20
30
40
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Cd38
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Cd38
siRNA
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Cd38
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siRNA 对照
Cd38
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siRNA 对照
Cd38
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siRNA 对照
Cd38
siRNA
siRNA 对照
图 4 Cd38 siRNA 对局灶性脑缺血的影响。
对 C57BL/6 J 小鼠进行 60 分钟短暂局灶性缺血，脑卒中 5 天后向侧脑室注射对照组或 Cd38 siRNA。b, Nissl 染色显示梗死大小无差异（n = 每组 8 或 10 只小鼠）。c, 免疫染色显示星形胶质细胞 CD38 因 Cd38 siRNA 而减少。 d, siRNA 抑制星形胶质细胞 CD38 可减少 7 天后 CSF 中 GFAP 阳性线粒体的数量（n = 每组 6 只小鼠）。e, Cd38 siRNA 减少了神经元线粒体（n = 每组 8 或 5 只小鼠）。 f, Cd38 siRNA 减轻了梗死周围 GAP43 免疫染色。 g, Western 印迹证实 Cd38 siRNA 处理的大脑中梗死周围 GAP43 蛋白减少（n = 每组 5 只小鼠）。
C，对侧半球；I，同侧半球。h，i，抑制 CD38 信号会恶化神经系统严重程度评分（neuroscore）（h）和网格行走测试（i）的神经系统结果（每组 7 或 9 只小鼠）。与第 3 天对照 siRNA 相比，*P < 0.05；与第 7 天 Cd38 siRNA 相比，#P < 0.05。 j, CD38 抑制降低了 CSF 线粒体的耗氧量（每组 n = 7 或 9 只小鼠）。数据为平均值 ± s.e.m。P 值来自非配对 t 检验（b、d、e、i）、单因素方差分析及 Tukey 检验（g）、重复测量双因素方差分析及 Bonferroni 检验（h）、双因素方差分析（j）或斯皮尔曼秩相关（k、l）。 m, CD38 对星形胶质细胞和神经元之间线粒体释放/转移假说的调控示意图。
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致谢 本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）、拉帕波特基金会和中国国家自然科学基金杰出青年学者奖的资助。
电子显微镜在系统生物学中心进行。细胞计量评估由病理学系流式和图像细胞计量核心支持。作者感谢 J. Felton 和 J. Zwicker 对 qNano 分析的协助。
作者贡献 K.H. 参与了稿件准备、假设提出、实验设计/分析并进行了实验。E.E.、X.W.、Y.T.、Y.L.和C.X.进行了实验并帮助分析数据。X.J.和E.H.L.参与了手稿准备、假设提出和实验设计。
作者信息 可从 www.nature.com/reprints 网站获取重印和授权信息。作者声明不涉及任何经济利益。
欢迎读者对本文的网络版发表评论。通讯和资料索取请联系：K.H. (khayakawa1@mgh.harvard.edu), X.J. (jixunming@vip.163.com) 或 E.H.L. (Lo@helix.mgh.harvard.edu)。
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重新评估
方法
没有使用任何统计方法来预先确定样本量。
试剂BAPTA-AM (A1076)、cADPR (C7344)、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐 (N0632) 和达那索水合物 (D7693) 购自 Sigma，RGDS 肽 (3498) 和 MNS (2877/50) 购自 R&D systems。
小鼠局灶性脑缺血模型。所有实验均按照机构批准的方案进行，符合美国国立卫生研究院的指导方针和美国公共卫生署的《实验动物的人类护理和使用政策》。我们的方法还包括符合 ARRIVE 指南（《研究中的动物：体内实验报告》）的随机化、盲法和统计标准。简言之，雄性 C57BL/6 J（12-14 周）或 FVB/N-Tg (GFAPGFP)14Mes/J 小鼠用 5% 至 1% 异氟醚麻醉，并监测直肠温度和脑血流量。中线皮肤切口后，通过小切口将涂有硅树脂的 7-0 尼龙单丝引入颈总动脉。在小鼠从麻醉中恢复后，通过激光多普勒血流测量仪和前肢屈曲度检查来评估小鼠是否有足够的脑缺血。对小鼠进行再麻醉，并通过拔出细丝建立再灌注。中风后的功能结果通过神经系统严重程度评分和足部故障测试进行评估。
原始神经元培养。原始神经元培养物取自胚胎日（E）17 Sprague-Dawley 大鼠胚胎或 E17 FVB/N-Tg (GFAPGFP)14Mes/J 小鼠胚胎的大脑皮层。简言之，解剖大脑皮层并使用木瓜蛋白酶解离系统（Worthington Biochemical Corporation，LK003150）进行解离。将细胞铺在涂有聚赖氨酸（Sigma，P7886）的平板上，并在含有 25 mM 葡萄糖、4 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 5% FBS 的 DMEM（NBM，Life Technology，11965-084）中培养，密度为 2 × 10 个细胞 ml（12 孔型为 1 ml，24 孔型为 0.5 ml）。播种 24 小时后，将培养基换成 Neurobasal 培养基（Invitrogen，21103-049），添加 B-27（Invitrogen，17504044）和 0.5 mM 谷氨酰胺。细胞在 37 °C、95% 空气和 5% CO 的湿润室内培养。培养物在播种后 7-10 天用于实验。
原代星形胶质细胞培养物。原代星形胶质细胞培养物取自 2 天大的新生 Sprague-Dawley 大鼠或 E17 C57BL/6 J 小鼠的大脑皮层。简言之，将解离的大脑皮层细胞悬浮在含有 25 mM 葡萄糖、4 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 10% FBS 的 DMEM（Life Technology，11965-084）中，并以 6 ×10 个细胞 cm 的密度培养在未涂布的 25 cm 平板上。1 型星形胶质细胞的单层细胞在培养 12-14 天后获得。小胶质细胞和神经元等非星形胶质细胞通过振荡从烧瓶中分离出来，并通过更换培养基去除。用胰蛋白酶解离星形胶质细胞，然后将其重新接种到无涂层的 T75 烧瓶上。细胞达到 70-80% 的汇合度后，将培养基换成含 1% 青霉素/链霉素的 Neurobasal 培养基或含 1% 青霉素/链霉素的 DMEM，24 小时后收集星形胶质细胞条件培养基（ACM）。收集的 ACM 经 2,000g 离心 10 分钟或 1.2-μm 注射器过滤器过滤后，将细胞碎片旋下，用于进一步实验。
OGD 和复氧OGD 实验使用专门的加湿室（Heidolph，培养箱 1000，Brinkmann Instruments）进行，温度保持在 37 °C，其中含有厌氧混合气体（90% N、5% H 和 5%CO）。为启动 OGD，用脱氧、无葡萄糖的 DMEM（Life Technology，11966-025）代替培养基。挑战 2 小时后，将培养物从厌氧室移出，用维持培养基取代培养物中的 OGD 溶液。然后让细胞在常规培养箱中恢复 18 小时（用于神经毒性检测）和 72 小时（用于 siRNA/胃细胞共培养）。
细胞活力测定。神经元损伤通过标准的细胞毒性检测方法进行测量，如使用细胞毒性检测试剂盒（罗氏应用科学公司，11644793001）检测乳酸脱氢酶（LDH）和/或细胞计数试剂盒 8 细胞毒性检测（DOJINDO，CK04-13）。对于 LDH 检测，在姊妹培养中使用 0.5% Triton X-100 诱导细胞 100% 死亡。通过与 100% 细胞死亡（LDH 检测）或作为 100% 细胞存活（CCK8）的对照细胞进行比较，对神经元损伤的相对评估进行归一化。
测定 CD38/ADPR 环化酶活性。如前所述，使用烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸（NGD）（Sigma，N5131）作为底物，用荧光测定 ADPR 环化酶活性。用 200 μM NGD 培养星形胶质细胞或神经元，然后用微孔板阅读器在 Ex 300 nm/Em 410 nm 的激发/发射波长下测定 cGDPR 的产生。
ATP 测量。细胞内或细胞外 ATP 由 CellTiter-Glo 发光试剂盒（Promega，G7570）测定，该试剂盒可进行细胞裂解并产生与 ATP 含量成比例的发光信号。简言之，在不透明的 96 孔板中加入培养基（50 μl）或细胞裂解液（50 μl）。
加入 CellTiter-Glo 发光试液（50 μl），室温下孵育 30 分钟。发光信号由发光微孔板阅读器测定。脂质体 ATP 处理。脂质体 ATP 由 Encapsula NanoScience 公司提供。简而言之，我们使用的冻干脂质体由 7:3 摩尔比的 l-α- 磷脂酰胆碱和 l-α- 磷脂酰丝氨酸组成，其中含有 ATP，水合后形成 100 nm 的脂质体 ATP。OGD后，将ATP负载脂质体（1-1,000 nM）与神经元共孵育，18小时复氧后分析细胞活力。
线粒体膜电位测量。为了监测线粒体的健康状况，我们使用 JC-1 染料（Invitrogen，T-3168）来评估线粒体膜电位。将大鼠皮质星形胶质细胞或培养基与 JC1（5 μM 或 1 μM）在 37 °C 下孵育 30 分钟。JC1 染料在线粒体中呈电位依赖性聚集，表现为荧光发射从绿色（Ex 485 nm/Em 516 nm）向红色（Ex 579 nm/Em 599 nm）的转移。线粒体膜电位是通过荧光微孔板阅读器的荧光比率测定的。
耗氧量分析。星形胶质细胞颗粒或 CSF 样品中的实时耗氧量由 Mito-ID 细胞外氧气传感器试剂盒（Enzo Life Science，ENZ-51045）按照 Enzo Life Science 提供的说明进行测量。简言之，在无涂层的常规 96 孔中制备星形胶质细胞（每孔 70-80% 融合细胞，每 100 μl）或颗粒部分（100 μl；25 倍浓缩的星形胶质细胞条件培养基），并在每孔中加入 Osensor 探针（10 μl）。在局灶性脑缺血后第 7 天从蝶窦采集 CSF 样本（8-20 μl）。2,000g 离心 10 分钟后，用 54 μl PBS 稀释 6 μl CSF，然后在每个孔中加入 6 μl Osensor 探针。用 100 μl（CSF 样品为 50 μl）Mito-ID HS 油覆盖平板后，在 30 °C 下用 340 nm 的激发和 642 nm 的发射滤光片组合读数。
电子显微镜分析。将大鼠皮质星形胶质细胞或来自星形胶质细胞条件培养基的颗粒在 2.0% 戊二醛和 0.1 M 加可底酸钠缓冲液（pH 7.4）（Electron Microscopy Sciences 公司）中固定 1 小时，室温下放在摇床上。然后用卡氏缓冲液冲洗，轻轻刮去，并在冰上用 1.0% 的四氧化锇在卡氏缓冲液中固定 1 小时。然后用缓冲液冲洗，并用 PBS 中的少量 2% 琼脂糖将它们固定在一起。然后用乙醇分级脱水至 100%，再用环氧丙烷脱水至 100%。在室温下，将 Epon:propylene oxide 1:1 溶液中的 Epon 树脂（Ted Pella）浸润在摇床上过夜。第二天，将它们放入新鲜的 Epon 中数个小时，然后在 60 °C 下嵌入 Epon 中过夜。薄片在 Leica EM UC7 超微切片机上切割，收集在涂有福尔马林的栅格上，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在 80 千伏的 JEOL JEM 1011 透射电子显微镜下进行检查。使用 AMT 数字成像系统（Advanced Microscopy Techniques）采集图像。这些方法与之前在星形胶质细胞培养物中检测细胞外颗粒和线粒体的方法类似。
FACS 分析。标准 FACS 分析由 BD LSR II 或 BD Fortessa 进行，如前所述。用 MitoTracker Red CMXRos 标记的大鼠皮质星形胶质细胞收集 ACM，然后用 1.2-μm 注射器过滤器过滤。上清液通过配置 561 nm 空气冷却激光的 FACSAriaII 细胞分拣仪对标记线粒体进行分拣。脑细胞采集自中风后的梗死周围皮层。简言之，将组织轻轻切碎，然后在 37 °C 下用鸡尾酒酶（I 型胶原酶、DNase I，Sigma Aldrich）消化 30 分钟。CSF 样品在 2,000g 离心 10 分钟后备用于进一步染色。使用未染色或表型对照进行 FACS 分析，以确定多变量流式细胞仪所需的适当门、电压和补偿。
测量颗粒大小。用 FACS 分离细胞外线粒体后的粒度由 qNano（iZON）测定。基于纳米孔的检测可以对复杂的混合物进行逐粒评估。通过调整孔的伸展度，可根据颗粒大小优化孔径，从而实现高精度测量。使用 FACS 分析法对含有线粒体的颗粒进行分类，然后使用 NP400 和 CPC400 校准颗粒对颗粒大小进行量化。
Western 印迹分析。Western印迹分析与之前报道的方法相同。使用 ProPREP 蛋白提取液（iNtRON Biotechnology, 17081）或 Qproteome FFPE 组织试剂盒（Qiagen, 37623）收集样本。将每个样本装载到 4-20% Tris-glycine 凝胶上。电泳后转移到硝酸纤维素膜上，在室温下用含 0.1% 吐温 20 和 0.2% I-block（Tropix，T2015）的三相缓冲盐水阻断 90 分钟。然后用以下一抗在 4 °C 下孵育过夜：抗β-肌动蛋白抗体（1:1,000, Sigma-Aldrich, A5441）、抗 GFAP 抗体（1:1,000, BD Biosciences, 556328）、抗 MAP2 抗体（1：500，Abcam，ab11267 或 ab32454）、抗 CD38 抗体（1:500，Santacruz，sc-7049）、抗 TOM40（1:200，Santacruz，sc-11414）、抗磷酸化 AKT（1:500，Cell Signaling，9271）、抗BCL-XL（1:500，Cell Signaling，2764）、抗活性 Caspase 3
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(1:200，Abcam，ab32042）、抗 AIF（1:500，Abcam，ab32516）和抗 GAP43（1:500，Santacruz，sc-17790）。与过氧化物酶结合的二抗孵育后，用化学发光（GE Healthcare，NA931（抗小鼠）、NA934（抗兔）或 NA935（抗大鼠））增强显像。使用 NIH 图像分析软件评估光密度。
免疫细胞化学和免疫组织化学。免疫细胞化学和免疫组织化学的方法如前所述。用一抗和荧光标记的二抗染色后，用或不用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行反染色，并放置盖玻片。使用荧光显微镜（尼康 ECLIPSE Ti-S）与数字电荷耦合器件相机和图像分析系统相连接，或使用卡尔蔡司激光扫描共聚焦显微镜 Pascal 5 LSM 和 Pascal 5 LSM 软件 3.2 版进行共聚焦显微镜分析，获得免疫染色图像或延时图像。树突的伸长在 MAP2 染色后进行评估，然后进行 NeuriteQuant 分析。
CRISPR 激活质粒转染。对照组 CRISPR 激活质粒（sc-437275）和大鼠 CD38 CRISPR 激活质粒（sc-437321-ACT）来自 Santa Cruz Biotechnology。转染按照圣克鲁斯生物技术公司的细胞培养转染方案进行。简言之，将 1 毫升质粒转染试剂混合物（转染试剂，sc-395739；转染培养基，sc-108062）与星形胶质细胞在 5%CO培养箱中于 37 ℃共培养 24 小时，然后评估 CD38 环化酶活性以确认转染效率。
siRNA 实验。对照 siRNA 和 Cd38 siRNA 均来自 Santa Cruz Biotechnology 公司。对照 siRNA（sc-37007）由乱序序列组成，不会导致任何已知细胞 mRNA 的特异性降解。小鼠 Cd38 siRNA（sc-37246）或大鼠 Cd38 siRNA（sc-270394）由 3 个特异性 19-25 核苷酸的 siRNA 组成，用于敲除基因表达。小鼠 Cd38 siRNA 的序列为5′-guguacuaccaacauucaa-3′，5′-gugugucuuaguagguau-3′，5′-ccaguuuguugauuguuga-3′。大鼠 Cd38 siRNA：序列 1：5′-CUCAAACCAUACCAUGUAA-3′；序列 2：5′-GGAAGAGCUUCCCAAUACA-3′；序列 3：5′-GUGUUAU CGUCUAGCAAUA-3′。
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统计分析。结果以均数±s.e.m表示。当仅对两组进行比较时，采用非配对t检验。多重比较采用单因素方差分析（Tukey's test）、双因素方差分析或重复测量双因素方差分析（Bonferroni test）。相关性通过斯皮尔曼秩相关进行评估。P < 0.05 被认为具有统计学意义。统计分析使用 GraphPad Prism 6 进行。
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扩展数据 图 1：星形胶质细胞线粒体颗粒检测。
a、电子显微镜分析表明，在细胞外星形胶质细胞衍生颗粒中检测到线粒体。在 ACM 中也发现了游离的线粒体。b, 在 FACS 分析中，使用对照珠对大小在 500 到 900 nm 之间的颗粒进行筛选。
d, FACS 分析从 ACM 中分离出细胞外线粒体部分后，通过 qNano 分析测量粒径。与电子显微镜分析一致，观察到一定范围的粒度分布（约 25%：300-400 纳米，约 75%：400-1,100 纳米）。
数据为平均值 ± s.e.m。
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扩展数据 图 2 星形胶质细胞线粒体的特征
a、线粒体颗粒经 FACS 鉴定。b、FACS 分析显示，在这些线粒体颗粒中，分别有约 79% 和 43% 的颗粒表达 β1-integrin 和 CD63、
cADPR (1 μM)似乎不会影响这些分布（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。数据为平均值 ± s.e.m。
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b, 星形胶质细胞的细胞内 ATP 水平受 cADPR 刺激而上调（n = 4 个独立实验）。与 0 μM cADPR 相比，**P < 0.01。 c. 为了测量细胞外颗粒中的 ATP 水平，收集 ACM 并通过离心和 1.2 μm 过滤器过滤排除大颗粒碎片。再经过
d，底部馏分的 ATP 含量较高，cADPR（1 μM）会增加该馏分的 ATP 含量（n = 2 个生物重复，n = 8 或 5 个独立实验）。e，细胞内钙通道阻滞剂 BAPTA-AM 可降低 cADPR 诱导的细胞外颗粒中的 ATP 含量（n = 2 个生物重复，n = 6 或 4 个独立实验）。数据为平均值 ± s.e.m。P 值来自单因素方差分析和 Tukey's 检验。
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扩展数据 图 4 | 图 2c 中的实验摘要。
a, 我们重复了图 2c 中的实验，每组 n = 4 个独立的原代培养物。结果相似（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。细胞外 mdACM 组与 ACM 组相比有显著差异。此外，在这一重复实验中，对照组（单独受到 OGD 损伤的神经元）与使用含线粒体的星形胶质细胞培养基（ACM）处理的神经元之间也存在统计学意义，而对照组与线粒体缺失组（mdACM）相比，也没有统计学意义上的明显恶化。综合来看，这两项不同的实验表明，星形胶质细胞线粒体诱导的神经保护作用不大，但在统计学上有显著意义。b, MitoTracker Red CMXRos（200 nM）在没有星形胶质细胞的情况下孵育，以获得无细胞来源的培养基（阴性对照）。收集培养基并与 OGD 后的神经元进一步孵育。24 小时后，未观察到线粒体信号。刻度线，100 μm。
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a, 神经元-星形胶质细胞共培养物的免疫细胞化学显示 CD38 主要在星形胶质细胞内表达。b，与神经元单独培养的培养基相比，与星形胶质细胞共同培养的神经元所收集的培养基中细胞外 ATP 水平更高（n = 3 个生物重复，n = 9 或 11 个独立实验）。但与星形胶质细胞共培养的神经元受到保护（n = 2 个生物重复，n = 6 或 4 个独立实验）。d, siRNA 抑制 CD38 会显著降低神经元-星形胶质细胞共培养物的细胞外 ATP 水平，但抑制 CD38 不会影响神经元-星形胶质细胞共培养物的细胞外 ATP 水平。
e, siRNA 阻断星形胶质细胞 CD38 可显著增加共培养物中 LDH 的释放（表明细胞损伤），表明 CD38 可能对维持神经胶质细胞稳态很重要（n = 2 个生物重复，n = 6 个独立实验）。免疫细胞化学显示，与对照组相比，通过 siRNA 抑制 CD38 可减少星形胶质细胞线粒体（红色）转移到神经元中。g, h, Western 印迹分析表明，通过 siRNA 抑制 CD38 可成功地在星形胶质细胞培养中进行而不影响细胞活力（n = 2 个生物重复，n = 4 或 3 个独立实验）。数据为平均值 ± s.e.m。
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扩展资料 图 6：星形胶质细胞的代谢抑制会导致神经细胞死亡，并阻止体外神经元的生长。
a、星形胶质细胞的乌头酶受到柠檬酸氟（FC）的抑制，从而破坏了星形胶质细胞的新陈代谢，并伴随着衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）信号。b、在这些代谢紊乱的星形胶质细胞中，细胞内 ATP 减少（n = 2 个生物重复，n = 6 个独立实验）。*c、碘化丙啶（PI）染色显示，氟柠檬酸盐（0.5 mM）不会诱导星形胶质细胞死亡。红色：聚集的 JC1；绿色：
单体 JC1。e, 大鼠皮质神经元与标记了 JC1 的星形胶质细胞共培养。共培养 24 小时后，对照组星形胶质细胞转移了线粒体，这些线粒体具有高膜电位。
(f，代谢紊乱的星形胶质细胞不能支持共培养中饥饿状态下神经元的活力（n = 4 个独立实验）。
进行了 48 小时的神经元生长测试。免疫细胞化学显示，代谢紊乱的星形胶质细胞阻止了神经元突起的生长，并增加了神经元细胞的死亡（n = 3 个独立实验）。 h, LDH 检测表明，氟柠檬酸盐（0.5 mM）不影响大鼠皮质星形胶质细胞（n = 4 个独立实验）或大鼠皮质神经元（n = 4 个独立实验）的细胞活力。数据为平均值 ± s.e.m。P 值来自单因素方差分析，然后进行 Tukey 检验（b）或非配对 t 检验（e-g）。
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a, 从 E17 FVB/N-Tg (GFAPGFP)14Mes/J 转基因小鼠中分离皮质神经元。
免疫细胞化学显示，培养的神经元在 OGD 后不表达 GFP 或 GFAP 蛋白，这表明中风样应激可能不会导致这种星形胶质细胞特异性 GFP 小鼠的 "泄漏"。
c，细胞分选前的代表性图像；d，细胞分选后的纯度；e，MAP2GFP 或 MAP2GFP 群体的 DAPI 阳性率分别为 92.5% 或 85.9%；f，Western 印迹分析表明，GFP 阳性和阴性神经元均表达成熟神经元标记（神经丝），但不表达神经元干细胞标记（nestin）。这些数据排除了 GFAP 阳性细胞包括已知也表达 GFAP 的神经元前体细胞亚群的可能性。
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扩展数据 图 8 | siRNA 抑制 CD38 的效果
a、Western 印迹显示，中风后第 1-7 天，CD38 在梗死周围皮层的表达增加。b、中风后 5 天，向侧脑室注射 Cd38 siRNA 或乱序对照组。c, 免疫组化法检测梗死周围皮层中 CD8 T 细胞和 Iba1 阳性的小胶质细胞/巨噬细胞。
对照 siRNA 或 Cd38 siRNA 之间的差异（n = 每组 6 只小鼠）。e, 培养的大鼠皮质星形胶质细胞经 OGD 2 小时后，再用对照 siRNA 或 Cd38 siRNA 处理。星形胶质细胞形态或 GFAP 表达通过
f，与对照 siRNA 相比，经 Cd38 siRNA 处理的培养星形胶质细胞的形态学变化不明显。 g，Western 印迹分析表明 siRNA 转染成功地降低了 CD38 的表达，但 GFAP 的表达没有变化。
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扩展数据 图 9 | 通过 FACS 分析确认神经元纯度
在体内。为了证实我们的 FACS 研究结果，我们使用了两种不同的已发表的标准方法。 a, 通过 FACS 对 MAP2 阳性群体进行筛选，并通过 Iba1（小胶质细胞/巨噬细胞）和 GFAP（星形胶质细胞）等标记物对分离的脑细胞样本进行进一步评估； b, 通过 FACS 对 MAP2 阳性群体进行筛选，并通过 Iba1（小胶质细胞/巨噬细胞）和 GFAP（星形胶质细胞）等标记物对分离的脑细胞样本进行进一步评估。
的 C57BL/6 J 小鼠。这些比较证实，MAP2 群体不包含任何数量可观的小胶质细胞或星形胶质细胞，而另一种神经元标记物（NeuN）则高度富集。
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a, b, cADPR (1 μM) 刺激培养的大鼠皮质星形胶质细胞 24 h。**c, 在细胞外发现了一些线粒体。 d, FACS 分析显示，1 ml ACM 中含有约 5 × 10 个线粒体。cADPR（1 μM）可显著增加培养基中线粒体的数量（n = 2 个生物重复，n = 6 个独立实验）。 e, 实验表量化了 OGD 后线粒体进入神经元的情况。在 24 孔培养板中制备大鼠皮质神经元（每孔 1 × 10 个细胞）。线粒体进入神经元的数量根据用 PBS 冲洗细胞前后测量的线粒体强度计算。使用不含酚红的培养基来降低背景信号。f，OGD 2 小时减少了 18 小时复氧后神经元中约 50%的线粒体（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。g，数据以相对值表示，OGD 2 小时/18 小时复氧后神经元线粒体总数为 100%。与 ACM 处理（11%）相比，cADPRACM 处理（18%）后进入神经元的线粒体略高，但无统计学意义（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。h
i，与 ACM 处理相比，cADPRACM 处理能更好地支持神经元活力（n = 2 个生物重复，n = 4 个独立实验）。
2 h。k, OGD 后，立即向神经元添加 dynasore（5 μM）、RGDS 肽（H-Arg-GlyAsp-Ser-OH；50 μg ml）或 MNS（3,4-亚甲二氧基-β-硝基苯乙烯；1 μM）30 分钟，然后进行星形胶质细胞共培养 18 小时。数据以相对值表示，星形胶质细胞胞外线粒体加上进入神经元的线粒体为 100%。m，Dynasore（5 μM）、RGDS 肽（50 μg ml）或 MNS（1 μM）不影响 OGD 2 小时后神经元的存活率（n = 4）。这些数据表明，星形胶质细胞线粒体颗粒进入神经元可能涉及整合素介导的 Src/ Syk 信号机制。然而，我们承认这些途径可能是多因素的，因此有必要进行更深入的分析，以剖析各种生理和病理条件下的进入机制。P 值来自单向方差分析，然后进行 Tukey 检验（a、i、k、l）或非配对 t 检验（d、g）。
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