序列比对/映射格式规范

1 SAM 格式规范

 1.1 示例

@HD VN:1.6 SO:coordinate
@SQ SN:ref LN:45
r001 99 ref 7 30 8M2I4M1D3M = 37 39 TTAGATAAAGGATACTG *
r002 0 ref 9 30 3S6M1P1I4M * 0 0 AAAAGATAAGGATA *
r003 0 ref 9 30 5S6M * 0 0 GCCTAAGCTAA * SA:Z:ref,29,-,6H5M,17,0;
r004 0 ref 16 30 6M14N5M * 0 0 ATAGCTTCAGC *
r003 2064 ref 29 17 6H5M * 0 0 TAGGC * SA:Z:ref,9,+,5S6M,30,1;
r001 147 ref 37 30 9M = 7 -39 CAGCGGCAT * NM:i:1

1.2 术语和概念

1.2.1 字符集限制

1.3 头部部分

1.3.1 定义的子排序术语

1.3.2 参考 MD5 计算

• 
  所有在包含范围 33 ('!') 到 之外的字符都会被剔除。这将移除所有不可打印和空白字符，包括空格和换行符。其他所有内容都会被保留，即使不是合法的核苷酸代码。
• 
  所有小写字符都被转换为大写。此操作相当于在 POSIX 区域中对字符调用 toupper()。
• 
  MD5 摘要的计算方法如 RFC 1321 所述，并以 32 个字符的小写十六进制数字表示。

1.4 对齐部分：必填字段

1. 
   QNAME：查询模板名称。具有相同 QNAME 的读取/片段被视为来自同一模板。QNAME '*' 表示信息不可用。在 SAM 文件中，一个读取可能占据多个比对行，当其比对是嵌合的或给出了多个映射时。
2. 
   标志：按位标志的组合。 每个位在下表中解释：

• 
  对于 SAM 文件中的每个读取/拼接，要求与该读取关联的行中只有一行满足 'FLAG & '。这一行称为读取的主行。
• 
  位 0x100 标记在某些分析中不应使用的对齐，当使用的工具意识到此位时。它通常用于在 SAM 中呈现多个映射时标记替代映射。
• 
  Bit 表示相应的比对行是嵌合比对的一部分。标记为 0x800 的行称为补充行。
• 
  Bit 是唯一可靠的地方来判断读取是否未映射。如果设置了 ，则无法对 RNAME、POS、CIGAR、MAPQ 和位 以及 做出任何假设。
• 
  位 0x10 表示 SEQ 是否已被反向互补，QUAL 是否被反转。当位 0x4 未设置时，这对应于段被映射到的链：位 0x10 未设置表示正链，而设置则表示反链。当 0x4 被设置时，这表示未映射的读取是否以其原始方向存储，即从测序仪上读取时的方向。
• 
  位 和 反映了所使用的测序技术中每个模板内的读取顺序。 如果 和 都被设置，则该读取是线性模板的一部分，但既不是第一个也不是最后一个读取。如果 和 都未设置，则模板中读取的索引是未知的。这可能发生在非线性模板中，或者在数据处理过程中丢失了该信息。
• 
  如果 未设置，则无法对 和 做出任何假设。
• 
  未在表中列出的位保留供将来使用。在写入时不应设置，在当前软件读取时应忽略。

3. 
   RNAME：比对的参考序列名称。如果存在 @SQ 头行，RNAME（如果不是 ）必须出现在其中一个 SQ-SN 标签中。没有坐标的未映射片段具有 ，在

• 
  “消耗查询”和“消耗参考”指示 CIGAR 操作是否导致比对沿查询序列和参考序列分别移动。
• 
  H 只能作为第一个和/或最后一个操作出现。
• 
  S 之间只能有 H 操作和 CIGAR 字符串的两端。
• 
  对于 mRNA 与基因组的比对，N 操作表示一个内含子。对于其他类型的比对，N 的解释未定义。
• 
  操作的长度总和应等于 SEQ 的长度。

7. 
   RNEXT：模板中 NEXT 读取的主要比对的参考序列名称。对于最后一个读取，下一读取是模板中的第一个读取。如果存在@SQ 头行，则 RNEXT（如果不是 ，或' '）必须出现在一个 SQ-SN 标签中。当信息不可用时，此字段设置为'*'，如果 RNEXT 与 RNAME 相同，则设置为' '。如果不是' '，并且模板中的下一读取有一个主要比对（另见 FLAG 中的位 ），则此字段与下一读取的主要行中的 RNAME 相同。如果 RNEXT 是 ，则无法对 PNEXT 和位 做出假设。
8. 
   PNEXT：模板中 NEXT 读取的主比对的基于 1 的位置。当信息不可用时设置为 0。此字段在下一个读取的主行中等于 POS。如果 PNEXT 为 0，则无法对 RNEXT 和位 做出任何假设。
9. 
   TLEN：签名观察到的模板长度。对于主读取，其中模板中所有读取的主比对都映射到同一参考序列，TLEN 的绝对值等于模板的映射结束与映射开始之间的距离，包括在内（即，结束 - 开始 + 1）。 请注意，映射的碱基被定义为与参考序列对齐的碱基，如 CIGAR 所描述，因此排除了软剪切的碱基。模板的最左侧段的 TLEN 字段为正值，最右侧段为负值，任何中间段的符号是未定义的。如果段覆盖相同的坐标，则选择哪个是最左侧和最右侧是任意的，但两个端点仍必须具有不同的符号。对于单段模板或当

1.5 对齐部分：可选字段

2 SAM 格式的推荐实践

1.  标题部分
   
   1 @HD 行应该存在，指定 SO 标签或 GO 标签（但不能同时指定两者）。
   
   2 如果读取已被映射，则应存在 @SQ 行。
   
   当 RG 标签出现在比对部分的任何位置时，头部中应有一个对应的 @RG 行，且 ID 标签匹配。
   
   当 PG 标签出现在比对部分的任何位置时，头部应有一个对应的 @PG 行，且 ID 标签应匹配。
2. 
   相邻的 CIGAR 操作应该是不同的。
3. 
   不应将任何比对分配映射质量 255。
4.  未映射的读取
   
   对于未映射的成对末端或配对读取，其配对已映射，未映射读取的 RNAME 和 POS 应与其配对相同。
   
   如果模板中的所有片段都未映射，则它们的 RNAME 应设置为 '*'，POS 应设置为 0。
   
   如果 POS 加上 CIGAR 中 操作的长度总和超过 @SQ 头行中 LN 字段指定的长度（如果存在），且 SN 等于 RNAME，则该比对应标记为未比对，除非参考序列是循环的（见下文）。
   
   未映射的读取应以它们从测序仪上获得的方向存储，并且其反向标志位 ( ) 应相应地未设置。
5.  多重映射
   
   当一个段在多行中出现以表示该段的多重映射时，这些记录中只有一个应未设置次级对齐标志位 ( )。RNEXT 和 PNEXT 指向模板中下一个读取的主行。
   
   2 SEQ 和 QUAL 的二次比对应设置为 ' 以减少文件大小。
6.  可选标签：
   
   如果模板有超过 2 个部分，则应存在 TC 标签。
   
   2 NM 标签应存在。
7. 
   循环引用序列

3 SAM 中描述组装序列的指南

3.1 无填充与填充表示

 3.2 填充的 SAM

@HD VN:1.6 SO:coordinate
@SQ SN:ref LN:47
ref 516 ref 1 0 14M2D31M * 0 0 AGCATGTTAGATAAGATAGCTGTGCTAGTAGGCAGTCAGCGCCAT *
r001 99 ref 7 30 14M1D3M = 39 41 TTAGATAAAGGATACTG *
* 768 ref 8 30 1M * 0 0 * * CT:Z:.;Warning;Note=Ref wrong?
r002 0 ref 9 30 3S6M1D5M * 0 0 AAAAGATAAGGATA * PT:Z:1;4;+; homopolymer
r003 0 ref 9 30 5H6M * 0 0 AGCTAA * NM:i:1
r004 0 ref 18 30 6M14N5M * * 0 0 0 ATAGCTTCAGC \
r001 147 ref 39 30 9M = 7 -41 CAGCGGCAT * NM:i:1

4 BAM 格式规范

4.1 BGZF 压缩格式

1. 
   头部中的 F.EXTRA 位被设置以指示存在额外字段。
2. 
   BGZF 使用的额外字段使用两个子字段 ID 值 66 和 67（ASCII 'BC'）。
3. 
   BGZF 额外字段负载的长度（gzip 规范中的字段 LEN）为 2（两个字节的负载）。
4. 
   BGZF 扩展字段的有效载荷是一个 16 位无符号整数，采用小端格式。该整数表示包含的 BGZF 块的大小减去一。