来自嫁接西瓜根际的合成群落通过微生物协同作用为未嫁接西瓜提供保护，使其免受尖孢镰刀菌的侵害

 抽象

 背景

植物微生物群有助于植物生长和健康，包括增强植物对各种疾病的抵抗力。尽管在了解植物抗病性方面取得了显著进展，但根际微生物群在增强西瓜抗土传病害方面的确切作用仍不清楚。在这里，我们构建了一个合成群落（SynCom），该群落由从嫁接西瓜植物根际获得的16个核心细菌菌株组成。我们进一步简化了SynCom，并通过简单的合成群落研究了具有协同相互作用的细菌在促进植物生长中的作用。

 结果

结果表明，SynCom显著增强了非无菌土壤中生长的未嫁接西瓜的生长和抗病性。此外，对扩增子和宏基因组数据的分析揭示了假单胞菌在增强植物健康方面的关键作用，SynCom接种后假单胞菌的相对丰度和生物膜形成途径的显着增加证明了这一点。基于体外共培养实验和细菌代谢组学分析，我们选择了假单胞菌以及与假单胞菌具有协同作用的 SynCom 的其他七个成员。它使我们能够进一步将最初构建的 SynCom 改进为包含八种选定细菌物种的简化 SynCom。值得注意的是，简化的SynCom的植物促进作用与最初的SynCom相似。此外，简化的SynCom通过细菌的协同作用保护植物。

 结论

我们的研究结果表明，SynCom在根际中增殖，并通过微生物协同相互作用减轻土壤传播的疾病，突出了微生物之间在促进植物健康方面的协同效应的潜力。这项研究为使用功能性 SynCom 作为可持续农业的有前途的解决方案提供了新的见解。

 视频摘要

 介绍

根际被认为是植物根系周围的土壤区域，也是土壤微生物的储存库[1]。在不同的根际微生物和植物根系中发生的相互作用，包括益生菌和致病类型，显着影响植物的生理性能，突出了根际微生物组在植物健康和生长中的重要作用[2,3,4,5]。因此，有针对性地操纵作物微生物群，特别是根际微生物组，成为优化未来可持续作物生产的有效策略。

化肥的过度使用和单一作物的密集施用破坏了土壤微生物生态系统的平衡，导致有益微生物种群的破坏，加剧了作物病害的流行[6,7]。值得注意的是，与易感作物（如未嫁接植物）相比，抗性作物（如嫁接植物）[8]由土壤传播病原体（如尖孢镰刀菌）引起的疾病症状较少[9]。根际微生物群移植（RMT）是植物病害管理的另一个有效工具。先前的研究表明，来自抗性供体的RMT可以正向调节土壤中的保护性微生物群，并有助于抑制枯萎病[10]。这些现象归因于根际中特定保护性微生物的富集，这些微生物可能与赋予病原体入侵的抗性有关[11]。最近的研究强调了植物根际中“核心微生物组”的概念。核心微生物组包括与不同环境中的寄主植物密切相关的持久性、高度丰富度、适应性强的微生物物种（具有广泛的生态位、有效的合作相互作用和对各种生境的耐受性等特征）[12,13,14,15]。在微生物群落中，一些被称为通才的分类群可以适应多种条件，并在各种环境或栖息地中茁壮成长，例如肠道或土壤[15,16,17]。多面手在多个特定栖息地的组合中持续存在，通常是核心微生物组的一部分。然而，需要注意的是，关于核心微生物组的一些发现和推论来自对“组学”数据的关联分析[14,15]。 通才作为抑制土壤传播疾病的核心微生物组的实际应用值得进一步验证和研究。

此外，以前的研究主要集中在无菌土壤条件下引入单核菌株。然而，自然环境包含复杂的天然微生物组。这些天然微生物组可以显着影响引入菌株的有效性和行为[18,19]。与传统的一次一个菌株的方法相比，合成群落（SynComs）已成为在非无菌环境中增强植物健康和赋予抗性的有效工具[17,20]。SynCom由核心微生物组成，它们协同工作以实现特定功能，如疾病控制、耐盐性和改善植物生长[17,20,21]。SynComs通常是基于这些微生物相互作用来设计和构建的[ 22]。鉴于非无菌环境（尤其是根际）中代谢物的高度复杂性，代谢物交换可能会驱动植物微生物组中的物种相互作用，例如交叉喂养产生的协同相互作用[23]。联盟中的协同相互作用在促进植物生长和减轻胁迫方面显示出广阔的潜力[24,25,26]，表明它们在设计益生菌群落中的应用。然而，关于使用来自健康根际的核心微生物群的最佳构建 SynCom 及其在促进植物生长和健康方面的有效性仍然存在一些争论。

西瓜无疑是全球最重要的园艺作物之一，年产量约为1.18亿吨。然而，由于连续单一栽培导致的真菌病害的发生，如西瓜镰刀菌枯萎病，它是由西瓜特异性病原体尖孢镰刀菌（F. oxysporum）引起的[8]。值得注意的是，通过应用嫁接技术获得的嫁接西瓜表现出改变植物地下微生物群落结构的能力[9]。这种改良导致即使在长期连续种植的田地中也能抵抗西瓜镰刀菌枯萎病。鉴于此，我们质疑嫁接的西瓜植物相关微生物群落如何响应尖孢镰刀菌感染。此外，我们仍然不清楚在非无菌环境中，来自嫁接西瓜根际核心微生物组的SynCom的保护作用程度，特别是对生物胁迫，如高病原体丰度。此外，开发一种用于构建和简化功能性 SynCom 的有效方法仍然不确定。

我们的方法包括评估未嫁接和嫁接西瓜植物的根际微生物群落结构和尖孢镰刀菌密度之间的差异。然后，我们从嫁接西瓜的根际进行了广泛的细菌分离，根据核心细菌在不同土壤肥力梯度上的广泛分布和适应性来选择核心细菌。接下来，我们组装了一个包含 16 种核心细菌物种的 SynCom，并评估了其在非无菌环境中增强植物健康的有效性，尤其是在存在生物胁迫的情况下。宏基因组和扩增子测序方法用于深入研究 SynCom 有益作用的潜在机制。此外，我们开发了一种有效的方法，用于基于SynCom成员之间的协同互动来构建和简化功能性SynCom。本研究提出了一种控制植物病害的新方法，并为西瓜种植和产业的可持续性提供了宝贵的见解。

 方法

田间实验设计和土壤样品采集

田间试验在中国南京市南京市花卉科学研究所（北纬31°43′，东经118°47′）进行。该地区属于亚热带季风气候，年平均气温为14.7°C。 该地区的土壤类型被归类为黄褐色土壤。西瓜田面积为56 m ² ，分为两个区域：一个是连续种植未嫁接的西瓜，另一个是连续种植嫁接西瓜（葫芦砧木）。每个区域由两个地块组成。采用随机块设计。自2014年以来，该地区每年都有春季和秋季的种植季节。在种植过程中，每个地块移植了16株幼苗。整个生长季节，日平均气温达到38°C，夜间平均气温为24°C。 西瓜田已经连续种植了八年（16个季节），直到2022年。

2022年10月，在西瓜植株开花期，通过连续种植未嫁接西瓜处理（简称未嫁接）和连续种植嫁接西瓜处理（称为嫁接）获得植物根际土壤样品。详细地，从每个样地中选出7株生长相似的植物（所有4个样地共28株）。因此，每个西瓜处理选择了 14 种植物。轻轻抖掉松散的粘附土壤，然后将样品安全地运回冰块中的实验室。将根样品置于 50 mL 离心管中，并向管中加入适量的无菌水，使根部浸没。将试管中的样品以180rpm振荡30分钟。然后取出离心管中的根部，并将管以4000×g离心10分钟。将离心的颗粒保留为根际土壤。最后，每个西瓜处理获得7个根际土壤样品（每个处理将两个单独的样品混合到一个样品中）。在提取DNA之前，所有根际样品都储存在−80°C。

DNA提取、测序和实时荧光定量qPCR

使用FastDNA™土壤DNA提取试剂盒（MP Biomedicals，Cleveland，OH，USA）提取根际土壤的总DNA。然后使用 Qubit® DNA 浓度检测试剂盒测量 DNA 浓度。选取各西瓜处理的7个根际土壤样品进行16S rRNA基因（V4-V5区）测序（LC-Bio Technology Co.， Ltd.， Shanghai， China）。实时荧光定量qPCR（qPCR）根据先前描述的方案测定根际土壤尖孢镰刀菌的丰度，并稍作修改[27]。有关详细的qPCR实验方案，请参阅补充方法1.1。

可培养细菌的分离和鉴定

如前所述，与田间嫁接西瓜根际相关的细菌被分离出来，并进行了微小的修改[28]。有关详细的隔离方案，请参阅补充方法 1.2。随后在LC-Bio Technology Co.， Ltd.对细菌全长16S rDNA进行测序，在NCBI网站上进行序列比对，并将每种微生物物种保存在−80°C的30%甘油（v/v）中。

在肥力梯度的土壤中培养可培养细菌

本研究旨在调查不同生境微生物群落的组成，以不同肥力梯度的土壤（高肥力和低肥力土壤的不同比例混合）为特征，以识别核心微生物。简言之，将高肥力和低肥力土壤以9种混合比例混合，将所有分离的细菌以等体积和OD接种 ₆₀₀ 到每个混合处理中。有关详细的实验设计，请参阅补充方法 1.3。在黑暗中孵育 90 天后，使用 FastDNA™ 土壤 DNA 提取试剂盒从所有处理土壤样品中提取总 DNA，然后进行 16S rRNA 基因绝对定量测序（Genesky Biotechnologies， Inc.， Shanghai， China）。有关详细的绝对定量测序方法，请参阅补充方法 1.4。

 壁龛宽度

我们使用“Shannon-Wiener”指数来分析生态位宽度。这种方法反映了每个物种所占据的不同生境的数量以及它们发生的均匀性[29]。广泛生活在不同肥力土壤生境的类群具有较高的生态位宽度值。因此，生态位宽度值较高和较低的分类单元可分别被视为通才和专家[ 30]。壁龛宽度是在 R 中使用“spaa”包计算的。

细菌SynCom的构成

在肥力梯度土壤中孵化实验的基础上，选取16种生态位宽度高（多面手）且广泛存在于9个土壤生境的微生物作为SynCom构建的核心微生物。全长 16S rRNA 基因的 Sanger 测序提供了每个分离株的 V4-V5 区域，然后可以将其映射回已鉴定的 16 种核心微生物的 ASV。因此，可以鉴定出16种核心微生物的代表性菌株（表S 1）。然后，将 16 个核心菌株中的每株接种在牛肉提取物蛋白胨肉汤 （NB） 培养基中，并在 37°C 下以 170 rpm 孵育过夜。将每种菌株的发酵液以4000×g离心5分钟，并重新悬浮在无菌水中， ₆₀₀ OD调节为0.1。将 16 种菌株的悬浮液以等体积 （v/v） 混合以建立 SynCom。本实验中使用的病原体尖孢镰刀菌菌株在我们的实验室中以-80°C储存在甘油中。首先将冷冻尖孢镰刀菌菌株在固体马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上在28°C下生长48小时。 然后，将其转移到新鲜马铃薯葡萄糖肉汤 （PDB） 中，并在 28°C 下培养 7 天。 尖孢镰刀菌孢子从PDB中收集，使用血细胞计数器定量，并稀释至10 ⁶ 孢子mL ⁻¹ 。

SynCom的疾病控制

采用温室盆栽试验研究了SynCom对西瓜镰刀菌枯萎病发病率的影响。简言之，未嫁接的西瓜植株幼苗（栽培品种：Zaojia 8424）接种SynCom（SBC）、尖孢镰刀菌（FON）、SynCom和尖孢菌（SBC + FON）或无菌水（对照，CK）。罐实验包括三个独立的生物学重复，每个包含九个技术重复。温室盆栽实验采用随机完全区组设计进行。每次重复在聚丙烯盆中运行，该盆中装满了600克干燥，非无菌土壤，没有西瓜种植史。盆栽试验在位于南京农业大学的温室中进行（白天：30°C下16小时，夜间：26°C下8小时）。接种 SynCom 一周后，接种尖孢鰕菌悬浮液。病原体感染6周后，我们测量了病害指数[31]、植株地上高度、鲜重、干重和根重（详细的病害指标测量方法见补充方法1.5）。如前所述，收集了盆栽实验的未嫁接西瓜根际土壤样品。如前所述进行DNA提取和qPCR。如前所述，随机选择每个接种处理的 8 个根际土壤样品进行 16S rRNA 基因（V4-V5 区域）测序。随机抽取3个根际土壤样本进行宏基因组测序（LC-Bio Technology Co.， Ltd.）。

 生物信息学分析

对于16S rRNA基因扩增子测序（引物参见补充方法1.6），首先对原始数据进行质量控制。使用USEARCH合并了双端读段[ 32]。通过“fastq_filter”命令选择高质量的序列，然后进行复制。使用USEARCH-unoise3算法消除单例，并使用“uchime_ref”命令排除任何嵌合序列[ 32]。其余序列用于生成扩增子测序变异 （ASV） 表，并使用核糖体数据库项目 （RDP） 分类器进行分类分配。使用 R 软件 （V4.3.1） 对分类单元注释结果进行统计和可视化。采用分子生态网络分析管道[33]进行共生网络分析。使用Gephi [ 34]对网络进行可视化。

使用FastQC（V0.11.9）[35]评估原始宏基因组测序数据的质量，然后使用Trimmomatic（V0.39）进行质量控制，以去除接头和低质量序列。Metaspades （V3.15.0） 用于序列组装成重叠群 [ 36]，而 Prodigal （V2.6.3） 用于预测编码序列 （CDS） [ 37]，CD-HIT 用于去冗余 [ 38]。使用Salmon（V1.4.0）将非冗余CDS映射到用于定量计算的干净读长[39]，并获得每百万次转录本（TPM）。利用非冗余CDS蛋白序列对基因组分类数据库（GTDB数据库）进行注释，获得群落物种分类信息[40]。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库用于功能注释[41]。Reporter Score方法用于通路富集分析[ 42]。还使用HMMSEARCH软件对碳水化合物活性酶（CAZy）数据库（CAZy）进行注释，并通过eggnog-mapper（V1.0.3）对eggNOG数据库（V5.0）进行注释。元链接方法用于通过具有相同标识符（即ORF ID）的开放阅读框（ORF）将物种信息与功能信息相关联。有关元链接方法的详细内容，请参阅补充方法 1.7。

核心微生物之间的体外相互作用

 上清液测定

为了探索核心微生物之间的相互作用，我们进行了体外菌株配对上清液测定。具体而言，将 16 个核心菌株中的每个菌株接种在 20 mL NB 培养基中，并在 37°C 下以 170 rpm 孵育 48 小时，直至达到平台期。然后将细菌培养物以8000rpm离心10分钟，并将上清液通过0.22μm无菌过滤器过滤，以获得每种菌株的废培养基（SM）。然后将每个菌株的培养物调整到相同的OD ₆₀₀ 值（= 0.1），并接种到所有菌株的SM（1%，v / v）中。将所得培养物在37°C下孵育48小时。对于对照，将每种菌株的调整培养物也分别接种到新鲜的NB培养基中。在孵育结束时，我们测量了所有培养物的OD ₆₀₀ 。结果表示为不同SM中菌株培养物的OD ₆₀₀ 除以菌株对照培养物的OD ₆₀₀ （即 ₆₀₀ OD消耗/新鲜）。每次治疗重复三次。

微生物相互作用的测定

微生物相互作用，无论是阳性、中性还是阴性，都是通过测量消耗/新鲜的OD ₆₀₀ 来确定的[24]。具体来说，为了对菌株之间的相互作用进行分类，我们使用 t 检验来比较三个独立实验的 OD ₆₀₀ 花费/新鲜是否显着大于或小于 1。如果 ₆₀₀ OD消耗/新鲜分别显著大于和低于1（P < 0.05），则将两种菌株之间的相互作用分为阳性（+）或负（−）。 对于其余样品（P > 0.05），相互作用被归类为中性（0）。

 代谢组分析

如上所述，将菌株在新鲜的NB培养基中培养。收集晚期稳定细菌上清液及其细胞外代谢产物。以无菌新鲜培养基为对照。使用UHPLC系统（Vanquish，Thermo Fisher Scientific）和UPLC BEH酰胺色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）与Orbitrap Exploris 120质谱仪（Orbitrap MS，Thermo）联用进行LC-MS/MS分析。有关详细的色谱实验方案，请参阅补充方法1.8。

简化 SynCom 对植物健康的影响

将8个核心菌株（表S 1）以相等的体积和OD混合 ₆₀₀ ，以构建名为SSC8的简化SynCom。此外，根据16种核心细菌菌株在共生网络中的程度（连接到节点的边缘数）进行排名（图S 13）。选取程度排名前四和前八的菌株，以等体积和OD ₆₀₀ 混合，分别构建SSC4D和SSC8D合成群落（表S 1）。SSC4D 和 SSC8D 组含有铜绿假单胞菌 Q6，它们被用作对照处理（即简化 SynCom 的其他方法）。同时，我们还设计了接种相同体积无菌水 （CK） 和初始 SynCom （SBC） 的治疗方法。用于每种处理的菌株如表S 1所示。合成细菌群落的组成、盆栽土壤的来源、种植方法和管理实践如上所述。为了研究简化的SynComs是否影响植物生长，该盆栽实验中没有一种处理剂补充病原体。6周后，测定地上部分的株高、根重、鲜重和干重。

 统计分析

细菌群落的α多样性是使用香农指数和丰富度指数估计的。采用基于Bray-Curtis距离度量的主坐标分析（PCoA）来探究细菌群落组成的差异。使用R中的“VennDiagram”包使用维恩图分析不同和共享的细菌，使用方差分析（ANOVA）确定使用R中的“agricolae”包进行多次比较的统计显着性。这些图是使用 R 中的“ggplot2”包创建的。图例包含详细统计分析的全面描述。

 结果

现场疾病发病率评估和 SynCom 开发

田间西瓜枯萎病发病率评估表明，未嫁接的西瓜植株的枯萎病发病率明显高于嫁接西瓜植株（图S 1a）。此外，嫁接植株根际的尖孢镰刀菌密度显著低于未嫁接植株（图S 1f）。未嫁接植物的根际微生物群与嫁接植物的根际微生物群有显著差异（图S 1）。为了探究嫁接植物根际微生物群的抑病潜力，开发有效的抗病SynCom，我们建立了一个包含394株田间嫁接西瓜植物根际细菌分离株的文库（图S 2）。由于嫁接植物表现出优异的抗病能力，因此从嫁接植物的根际微生物群中分离出的细菌被选为SynCom的候选菌株（图S 3）。结果表明，不同生境（9种不同肥力梯度土壤）的土壤理化性质和细菌群落组成存在显著差异（补充方法1.3;图 S 4;表S 2）。鉴于此，我们通过将单个微生物分类为通才（前 10%，32 个扩增子序列变体 （ASV））或专家（后 10%）来评估单个微生物的生态位宽度（图 S 5a、b）。此外，在所有9个生境中普遍发现了67个ASV（常见ASV）（图S 5c）。根据我们对核心微生物的定义，即通才和普通 ASV 之间共享的微生物，我们确定了 16 种核心微生物（16 个相似性为 97% 的簇，源自 32 个 ASV;图 S 5d;表S 3）。 值得注意的是，经过90天的培养，这16种微生物仍然存在于所有9个生境中，并且具有较高的相对丰度（图S 5e）。尽管这些微生物仅占总丰富度的5%，但在属级注释中，它们几乎占总绝对丰度的75%（图S 6）。全长 16 S rRNA 基因扩增子的 Sanger 测序提供了每个分离株的 V4-V5 区域，然后可以将其映射回核心微生物的 ASV。最终，可以鉴定出16种核心微生物的代表性菌株（表S 1;表S 3），包括墨西哥假黄单胞菌Q1、Pseudorhodoferax aquiterrae Q2、Rhizobium daejeonense Q3、Lysobacter panacisoli Q4、Sphingopyxis soli Q5、铜绿假单胞菌Q6、Ensifer numidicus Q7、Noheartides kongjuensis Q8、Microbacterium arborescens Q9、布加肠杆菌Q10、无色杆菌粘液菌Q11、Olivibacter jilunii Q12、气单胞菌Q13、Bosea eneae Q14、Arthrobacter.sp Q15和皮特不动杆菌Q16。为了进一步评估核心微生物对未嫁接西瓜植株健康的影响，我们将这16个核心菌株组合在一起，构建了一个合成群落，以下简称SynCom。

SynCom促进了未嫁接的西瓜生长，缓解了疾病

我们在温室条件下（在非无菌盆栽土壤中）设计了四个不同的处理组，其中未嫁接的西瓜植株接种无菌水 （CK）、SynCom （SBC）、尖孢镰刀菌 （FON） 以及 SynCom 和尖孢菌 （SBC + FON）。结果表明，SBC组的生长明显优于CK组和FON组，高度和鲜重值显著高于CK组，干重比CK组高29%（图1）。SBC+FON组的株高、鲜重和根重均显著高于FON组（图1a–d）。此外，与FON组相比，SBC + FON组对未嫁接的西瓜植株具有明显的抗病性（图1g，h）。具体而言，与FON组相比，SBC + FON组表现出显著较低的疾病指数（降低55.6%）和尖孢镰刀菌丰度（降低8.4%）（图1g-j）。将SBC+FON组与FON组进行比较时，相对控制效果达到68.0%（图1k）。此外，SynCom 中的 11 株菌株（靶向 ASV）能够在接种 SynCom 的条件下成功定植根系（图 S 7;补充方法1.9和2.1）。而 SynCom 的其他五个成员则没有显示出来，因为它们低于过滤标准（图 S 8）。总体而言，SynCom接种可增强植物生长和抗病性。

 图1

该联盟促进了植物生长并减轻了疾病。a–d 未嫁接西瓜植株的枝条高度、鲜重、干重和根重。e-h 接种无菌水 （CK）、SynCom （SBC）、SynCom 和尖孢镰刀菌 （SBC + FON） 和尖孢镰刀菌 （FON） 后 6 周未嫁接西瓜植株的代表性图像。i 不同处理（CK、SBC、SBC + FON 和 FON）下的镰刀菌枯萎病指数。j 不同处理植物根际的尖孢镯密度。k 接种的SynCom的相对控制效果。相对控制效果（%）=[（控制疾病指数—治疗疾病指数）/控制疾病指数]×100。这里，对照组是指FON组，治疗组是指SBC+FON组。根据 Duncan 检验 （n = 8–10），方框上方的不同字母表示 P < 0.05 处的显着差异。接种无菌水的CK未嫁接西瓜植株，接种SynCom的SBC未嫁接西瓜植株，接种SynCom和尖孢镰刀菌的SBC+FON未嫁接西瓜植株，接种尖孢镰刀菌的FON未嫁接西瓜植株

SynCom接种后根际细菌群落特征的变化

为了阐明SynCom保护作用的潜在作用机制，比较了4个治疗组的根际微生物群落组成和宏基因组谱。我们观察到FON组的微生物多样性明显低于其他处理组（图2a）;然而，SBC+FON组的多样性与CK组和SBC组的多样性相当，表明SynCom接种可以使微生物多样性正常化，以应对病原体侵扰。使用Bray-Curtis距离的PCoA显示SBC + FON和FON组的微生物谱之间存在显着差异（图2b）。属级注释显示，在SynCom接种后，假单胞菌属、肠杆菌属、独核杆菌属和链霉菌属成员的相对丰度增加（图2c）。SBC和SBC + FON组中属于这些靶向ASV的16株菌株的相对丰度之和高于CK组和FON组（图2d），与16株菌株对应的ASV相对丰度之和与病原体丰度呈显著负相关（图2e）。除了微生物多样性和群落组成的变化外，我们还观察到不同群体微生物组内共生网络的变化。SBC和SBC + FON组的微生物组网络分别比CK组和FON组复杂得多，节点和边缘数量更多，模块化程度更高（图S 9a-f），网络稳定性（如鲁棒性、连通性）提高（图S 9h-i）。接种SynCom也在一定程度上增加了社区的积极凝聚力（图1）。 S 9g），可能促进社区微生物合作，促进抗病性（图S 10）。

 图2

接种SynCom的植物根际微生物群落组成和功能特征的变化。a CK、SBC、SBC + FON和FON组的细菌α多样性（n=8种生物独立植物）。b 细菌群落的Bray-Curtis相似性分析。c 每个处理组在属水平上的细菌相对丰度（前 10 名）。d 不同处理组根际核心微生物ASV的相对丰度。将菌株 16 S rRNA 基因的 V4–V5 亚区与 ASV 相匹配，作为菌株在根际中存在和相对丰度的指标（表 S 4）。e 对应于 16 个菌株中每个菌株的 ASV 相对丰度之和与每个治疗组中尖孢镰刀菌密度的相关性分析。f 报告基因评分条图比较了不同治疗组 （n = 3） 中 KEGG 通路的丰度。虚线表示报告者得分为 1.69，这是表示此类分析中显著差异的阈值。红色条表示在 SBC 或 SBC + FON 组中显着富集的代谢途径。蓝色条表示在CK或FON组中显着富集的代谢途径。g 参与生物膜形成的功能基因的丰度差异 （TPM） - 铜绿假单胞菌通路。这里显示的基因丰度是 Z 分数标准化的。h 在生物膜形成中显著富集的基因——SBC 组中的铜绿假单胞菌通路使用元连接方法追溯到物种分类学。i 在生物膜形成中显著富集的基因——SBC + FON组中的铜绿假单胞菌通路可追溯到物种分类学

SynCom触发的西瓜根际群落功能响应

我们使用宏基因组学来确定由 SynCom 触发的根际群落的功能特性。结果表明，SBC和SBC + FON组微生物组的功能组成与CK组和FON组有显著差异（图S 11a-c）。为了进一步表征微生物功能，我们首先将所有基因注释到KEGG数据库中。然后，我们将报告特征算法与 KEGG 代谢网络、通路注释和相对基因丰度 （TPM） 相结合，发现 CK 和 SBC 组之间以及 FON 和 SBC + FON 组之间的 KEGG 通路丰度存在显着差异。值得注意的是，SBC和SBC + FON组的相同途径被富集，包括双组分系统、生物膜形成等（图2f）。SynCom处理（SBC和SBC + FON）组也显著增加了参与RNA加工和修饰以及细胞运动的模块的丰度（图S 11d）。

值得注意的是，发现SynCom接种可显著增加根际假单胞菌的丰度（图2c）。在SynCom成员中，属于目标ASV 37的假单胞菌表现出有效的植物根系定植能力（图S 7）。相关性分析显示，假单胞菌的相对丰度（ASV 37）与根际病原体的丰度之间存在显著的负相关（图12）。此外，我们的宏基因组学分析强调了 SynCom 处理组中假单胞菌生物膜合成途径的显着富集。这些发现表明，假单胞菌表现出与SynCom接种处理及其对植物病害的影响密切相关的特别显着的模式。因此，我们发现假单胞菌在增强植物健康方面至关重要，促使我们对该分类单元进行更详细的检查。

我们的下一个重点是检查SynCom接种在假单胞菌生物膜形成途径中的基因水平上诱导的变化。宏基因组分析显示，与CK组和FON组相比，SBC和SBC + FON组的假单胞菌生物膜形成途径中共有16个显著富集的基因（图2g）。这些基因大多与c-di-GMP信号通路、Gac/Rsm通路和Psl多糖生物合成有关，显著影响细菌运动和生物膜形成[43,44]。为了确定可能在基因富集过程中发挥关键作用的特定细菌分类群，我们进一步确定了这些显着富集基因的物种分类起源。流图表明，这些富集的基因主要来源于SynCom的成员（图2h-i）。总体而言，这些发现表明假单胞菌在西瓜植株的疾病抑制和生长促进中起关键作用，并且SynCom的其他成员驱动了假单胞菌生物膜形成途径的富集。

SynCom成员之间的潜在互动

基于上述扩增子和宏基因组学分析，我们假设SynCom成员与假单胞菌之间的协同相互作用有助于假单胞菌在根际系统中的生长和定植，最终促进植物生长。为了进一步验证这一假设，我们采用体外共培养系统来评估SynCom菌株对假单胞菌的协同作用。

我们主要观察到共生网络中这些核心微生物之间的正相关关系（图 S 13）。然后，通过计算其功能距离来确定这些核心菌株的竞争潜力分析（图14;参见补充方法1.10），揭示了它们之间的低水平竞争。为了进一步确定这些核心菌株之间的相互作用，我们使用了上清液测定和代谢组学分析。详细地说，我们在其他 SynCom 成员的无菌废培养基 （SM） 中培养每种菌株，以评估每个 SM 中由废物或细菌素介导的 SynCom 成员之间的相互作用。结果表明，墨西哥假单胞菌Q1、南半球菌Q2和双歧杆菌Q14的SM显著促进了~60%的SynCom菌株（OD ₆₀₀ 消耗/新鲜>1）的生长（图3a）。

 图3

单个 SynCom 菌株之间的体外相互作用基质和底物耗竭曲线。a 通过三个独立的实验测定了新鲜培养基中不同菌株培养物和各自用过培养基（SM）的平均OD ₆₀₀ 。 ₆₀₀ > 1 和 < 1 的 OD 消耗/新鲜值分别表示菌株生长的促进和抑制。 b 使用OD ₆₀₀ samp/fresh值，生成成对交互作用矩阵。该比率显著> 1 （P < 0.05） 的相互作用用 （+） 表示，该比率显著< 1 的相互作用用 （ −） 表示，比率与 1 没有显著变化的相互作用用 （0） 表示。c 通过三个独立实验的非靶向质谱确定新鲜培养基中细菌生长至固定相后底物的消耗曲线。与新鲜培养基相比，16 株菌株的代谢组学特征（行）显著降低（与新鲜培养基相比，P < 0.05）以红色显示。深红色表示代谢组学特征的强烈耗竭，而白色表示代谢组学特征没有耗竭。d 相对于每个菌株的耗尽代谢组学特征总数（如图 S 15 所示），耗尽代谢组学特征的成对重叠，例如，墨西哥假单胞菌 Q1 与其 P. aquiterrae Q2 共享其 454 个耗尽代谢组学特征中的 208 个代谢组学特征，相当于 45.81%。相比之下，由于 P. aquiterrae Q2 仅从新鲜培养基中总共消耗了 284 个代谢组学特征，因此相对于 P. aquiterrae Q2 和 P. mexicana Q1 之间共享代谢物的重叠率为 73.24% 相对于 P. aquiterrae Q2 耗尽的代谢组学特征的总集。 e 消耗/新鲜消耗的OD ₆₀₀ 与消耗曲线中的成对重叠的相关性分析。蓝点代表涉及所有菌株的生长，红点仅代表铜绿假单胞菌Q6在其他7种菌株的SM中的生长。f 通过比较两种菌株的SM代谢谱（由非靶向MS确定）来鉴定潜在的交叉喂养代谢物。蓝色表示其中一种菌株产生代谢物，红色表示其伴侣可以消耗代谢物

为了确定SynCom菌株内相互作用的方向性和模式，我们构建了一个基于OD ₆₀₀ 消耗/新鲜值的相互作用矩阵。该矩阵主要将菌株之间的相互作用分为竞争性（− / − ， 120 个相互作用中的 34 个）或经界性（0/ − 或 − /0,120 个相互作用中的 30 个）（图 3b）。我们发现有七种菌株增强了铜绿假单胞菌Q6（铜绿假单胞菌Q6）的生长（即那些与铜绿假单胞菌Q6表现出正相互作用（+）的菌株）。其中，3株菌株与铜绿假单胞菌Q6发生互惠互作（+/+）（图3b）。为了研究代谢促进是否驱动铜绿假单胞菌Q6与这7株菌株之间的协同合作，我们对这8株菌株的SM进行了代谢组学分析，揭示了这些SM的可变代谢组学特征（图3c）。此外，对底物消费概况重叠的评估（Fig. 3d）表明，铜绿假单胞菌Q6与其他7种菌株的重叠较少。将SM中的生长促进（OD ₆₀₀ 消耗/新鲜）与消耗曲线（Fig. 3d）中的成对重叠相关联，表明较小的重叠与相应SM中较强的生长促进相关（R ² = 0.28，P < 0.001，图3e）。 值得注意的是，铜绿假单胞菌Q6与其他7株菌株的底物耗竭重叠程度较低，体外表现出较强的协同生长效应（耗氧耗 ₆₀₀ /鲜>1，红点）（R ² = 0.84，p = 0.003，图 3e）。为了探索铜绿假单胞菌 Q6 与三种表现出互惠关系的菌株之间潜在的交叉摄食代谢物，我们深入研究了 SM 的代谢组学数据，以寻找这些菌株中富集（或耗尽）的特征。 我们在这些菌株的SM中鉴定出正乙酰丝氨酸和赖氨酸-羟脯氨酸等化合物（图3f），表明这些物种之间存在代谢交叉摄食潜力。总体而言，这些结果清楚地表明，菌株之间的生长促进主要归因于基质消费曲线的较小重叠。

根际8种联盟的性能

我们进一步研究了由8种细菌菌株（铜绿假单胞菌Q6和7种具有协同作用的菌株，称为SSC8）组成的简化SynCom在未嫁接西瓜植株中的生长促进作用。我们观察到，与CK相比，SSC8组的植株表现出显著的生长增强（图4a）。值得注意的是，SSC8组植物的生长参数，包括株高、根重和干重，与初始SynCom（SBC）组相当（图4b-d）。然而，当铜绿假单胞菌Q6与SynCom其他菌株（SSC4D和SSC8D组）联合使用时，其生长促进作用明显弱于SBC组。这些结果支持了简化的SynCom可以通过其中存在的微生物之间的协同相互作用来诱导有益效果的假设，从而促进植物健康，达到与初始SynCom相同的程度。

 图4

各种简化的 SynCom 对植物生长的影响。a 无菌水接种后6周未嫁接西瓜植株的代表性图像（CK）、网络度排名前4位的物种（SSC4D）、网络度排名前8的物种（SSC8D）、具有协同作用的8种（SSC8）和所有16个核心菌株（SBC）。b–d 植物的枝条高度、根重和干重。字母表示显著差异（P < 0.05）

 讨论

以往的研究和经验表明，未嫁接的西瓜植株的连作导致严重的连作障碍，导致植株生长受到抑制，最终枯萎死亡[8]。相反，嫁接的西瓜植株已被证明始终表现出健康的生长。此外，据报道，嫁接的西瓜植株即使在以前连续种植未嫁接西瓜的土壤中种植也能茁壮成长并保持健康生长。值得注意的是，植物根际微生物群在植物生长、健康和病原体抗性中起着重要作用[45,46,47,48]。因此，我们重点研究了嫁接西瓜植株根际微生物群的SynComs，以了解它们在保护未嫁接西瓜植株健康中的作用以及潜在的相互作用机制。

在我们的研究中，我们观察到在高度多样化的嫁接植物根际微生物群落中，病原体的丰度显着降低，这表明疾病抑制是集体微生物相互作用的结果，而不是单个物种的作用。我们还鉴定了几种众所周知的潜在生物防治类群，如链霉菌[20]和根瘤菌[49]，与未嫁接的植物相比，它们在嫁接植物中富集。这些结果表明，嫁接的西瓜植株改变了根际微生物群落的组成，这些群落通过招募特定微生物在维持植物健康和抑制镰刀菌枯萎病方面发挥着至关重要的作用[50,51,52]。重要的是，嫁接西瓜植物的根际微生物群落可以作为农业生物防治的宝贵资源，扩大具有潜在生物防治应用的可培养微生物库。

破译核心分类群及其与寄主植物和致病病原体的相关性对于利用植物微生物组促进植物生长和健康至关重要[3,12,20]。然而，目前尚不清楚嫁接西瓜根际中的哪些核心微生物执行特定功能。越来越多的研究表明，核心微生物可以定义为在各种栖息地或环境中持续存在的高占有率分类群[15,53]。从生态学的角度来看，通才是那些栖息在各种环境或环境梯度中的类群[17]，表现出高占有率或生态位宽度，并在与生境相关的多个组合中持续存在。因此，这些多面手物种大多是微生物群落的核心成员[15,16]。为了鉴定微生物的多面手，将分离的菌株以等体积混合并接种到不同的生境（具有不同肥力梯度的九种土壤）中。很明显，具有不同肥力梯度的土壤在物理和化学性质上表现出明显的变化。不同生境间细菌群落组成也存在显著差异。这些发现进一步强化了土壤肥力梯度作为强环境过滤器的观点，使得在不同肥力梯度土壤中建立不同的微生物群落成为可能。因此，每个具有肥力梯度的土壤都被认为是一个潜在的栖息地。通过分析不同生境中可培养微生物的生态位分布，筛选核心微生物构建合适的微生物组合，从而提高抗病微生物群落的组装效率。

SynCom接种植物的根际细菌群落（SBC和SBC + FON组）的肠杆菌、假单胞菌和单杆菌的相对丰度明显高于CK组和FON组。这些属中的许多菌株以前已被记录为增强植物生长和增强植物对疾病的抵抗力[54,55]。尽管我们的研究还表明，接种SynCom增加了植物根际微生物网络的复杂性和稳定性，但微生物群落数据是组成性的[56]，使用Spearman相关性在组成数据上构建共关联网络可以导致虚假相关性的识别[57]。

此外，微生物在根系或根际的定植对于控制土壤传播疾病的发生至关重要，并且是微生物菌株重要性的共同指标。一种流行的方法包括评估微生物序列的读取计数，以估计天然微生物组中微生物的存在或定植水平[17]。根据这种方法，SynCom 的 11 个成员在 SBC 和 SBC + FON 组的植物根际中富集和定植。单个菌株的丰度与其触发特定效应（如增强抗病性）的能力之间的相关性反映了该菌株的相对重要性[58]。我们将这一概念和方法扩展到SynCom，并利用相关性分析进一步验证了SynCom丰度（对应于16个菌株的ASV相对丰度之和）对植物抗病性和核心微生物重要性的影响。我们的数据还揭示了SynCom接种后根际细菌的功能组成发生了显着变化，特别是显示出生物膜形成等途径的丰度增加。生物膜的形成有助于植物吸收养分，并作为对抗疾病的生物防治机制[59]。例如，拟南芥的霜霉病感染触发了三种细菌联盟的形成，该联盟协同相互作用并促进生物膜的形成，从而降低了疾病的发生率[46]。此外，促进植物生长的根际细菌通过交叉摄食与天然细菌协同作用，从而协同生物膜的形成，增强植物促进生长和盐胁迫缓解能力[29]。 我们的研究结果强调，显著富集途径的表达在帮助西瓜植株抗病促生长方面起着至关重要的作用。因此，SynCom的应用是RMT的一种有前途的方法，特别是在控制土壤传播疾病方面显示出巨大的潜力[10]。

我们进一步观察到，SynCom接种导致根际假单胞菌的相对丰度增加，特别是特异性显性ASV 37，其表现出最强的反应，并且与尖孢子菌的丰度呈负相关。假单胞菌在支持植物健康方面表现出多种潜在的有益作用，包括抗生素的产生和诱导的全身耐药性的激活[60,61,62,63]。例如，假单胞菌通过诱导植物的全身抗性，对镰刀菌枯萎病等土壤传播疾病具有显著的生物防治功效[60]。先前的研究表明，与抑制植物病害（例如假单胞菌）相关的特定微生物群可能受到外部刺激的影响，例如生物有机肥的施用[47]或SynCom接种[26]。刺激这些土壤微生物群的活性可以特别增强植物病害抑制作用。有趣的是，我们发现 SynCom 接种导致假单胞菌生物膜形成途径显着富集。协同生物膜的形成是有益植物相关微生物的共同性状[45,46]。根系相关细菌通常栖息在多物种生物膜中，这种生活方式促进了共生群落中多种特征的出现，例如抗生素耐药性增加、水平基因转移和共享共同代谢产物[64]。此外，微生物的正相互作用可以增强根际中的生物膜形成和微生物定植，从而改善植物健康[65,66,67,68]。 这些疾病抑制或生长促进作用通常归因于细菌种群的集体行动，而单个物种的作用导致较弱的结果[69,70]。因此，SynCom接种有可能通过种间协同效应进一步增强假单胞菌在根际的定植，从而有效地促进生长[26,47]。尽管这项研究现在已经阐明了SynCom的功能和相关性，但它们的保护和合作机制仍然需要通过基于体外培养的方法进行个人和集体验证。

有趣的是，本研究中选择的核心微生物比可培养微生物的其他成员表现出更积极的共生模式，表明驱动核心细菌共存的非竞争关系。这可能归因于生态位划分，这降低了它们的竞争压力并允许它们共存[71]。我们的功能距离计算结果支持了这一建议。我们使用上清液培养实验进一步研究了 SynCom 成员之间的成对相互作用。值得注意的是，7个菌株对铜绿假单胞菌Q6具有促进作用，可能是因为这些菌株具有不同的消费特征，这可能导致对资源的竞争最小化，使它们能够共存甚至互利[72]。这些结果表明，两种细菌之间的代谢消耗曲线重叠越小，它们就越倾向于相互合作，例如促进代谢交叉喂养[73]。由营养交换介导的协同相互作用有助于细菌联盟的稳定性，确保联盟的最佳功能[21,26]。最后，验证了由铜绿假单胞菌Q6和与之正相互作用的7个物种组成的简化SynCom（SSC8）是否能增强植物健康。我们观察到 SSC8 诱导了与初始 SynCom （SBC） 相似的植物生长促进。尽管其他简化的SynCom（SSC4D和SSC8D组）含有铜绿假单胞菌Q6，但并非这两种处理的所有其他成员都与假单胞菌协同作用。这两个简化的SynCom也没有表现出明显的增长促进作用。 这些结果表明，应用由假单胞菌和其他与假单胞菌协同作用的菌株组成的SynCom对植物健康具有协同作用，包括促进植物生长。这一发现强调了有益核心微生物在增强植物健康方面的重要性，特别是在与假单胞菌的积极相互作用的背景下[26,74]。受SynCom成员在植物根系中的定植作用和体外正相互作用的启发，我们建议SynCom成员可以作为先驱者，在植物早期生长阶段占据根际中可用的生态位[75,76]。通过新陈代谢，它们分泌的代谢物可以增强SynCom和后继假单胞菌内假单胞菌的活力[26]。根据这一建议，其他七种菌株的代谢物（SM）可以促进假单胞菌的生长。与代谢组学数据一致，铜绿假单胞菌Q6具有更强的利用有机酸的能力，一些菌株可以分泌有机酸，这些有机酸可以被铜绿假单胞菌Q6代谢。因此，在构建SynCom时，应强调最佳菌株组合，例如更稳定或更合作，而不仅仅是更多的菌株[46,77]。

 结论

在这里，我们报道了栖息在嫁接西瓜植物根际的核心细菌作为SynCom，可以有效控制疾病并促进未嫁接植物的生长。研究发现，SynCom接种显著提高了根际假单胞菌的相对丰度，增强了假单胞菌生物膜形成途径，表明假单胞菌在植物健康和抗病性中起着关键作用。体外试验表明，一些SynCom成员和假单胞菌之间的代谢促进提高了假单胞菌的适应性。基于SynCom成员的种间协同效应，构建了由8个核心微生物组成的简化SynCom。重要的是，这个简化的版本保留了在原始 SynCom 中观察到的促进增长的效果。我们的研究强调，构建和简化SynCom是保护在天然土壤中生长的植物免受生物胁迫的有效策略。本研究提出了一种使用具有协同效应的微生物接种剂促进植物健康的生态方法，展示了理解和操纵根际微生物相互作用的重要性。