睡眠呼吸障碍患者软腭组织的组织学评估
睡眠呼吸障碍患者软腭组织的组织学评估
作者的贡献 A-项目研究 B-数据收集 C-统计分析 D-数据解读 电子稿件准备 F-文献分析 G 筹款
Justyna Panek
, Joanna Reszećct
, Marek Rogowski
, Ewa Olszewska
. 比亚韦斯托克医科大学耳鼻喉科系;系主任:Marek Rogowski 教授,医学博士。 比亚韦斯托克医科大学医学病理学系;系主任:Joanna Reszeć, MD, PhD
文章历史: 接收: 2019.08.09 接受: 2019.12.05 发表: 2019.12.06
摘要:背景:睡眠是人体正常运作必不可少的生理状态。阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)是导致睡眠障碍的原因之一。
目的:本研究旨在评估不同形式 OSAS 患者的软腭粘膜组织学情况。 材料和方法:研究组由原发性打鼾或 OSAS 形式的睡眠呼吸障碍患者组成。对比组包括无睡眠呼吸障碍病史的慢性腭扁桃体炎患者。在手术过程中收集腭悬雍垂(研究组)和腭舌弓(对比组)的粘膜碎片进行组织学检查。采用组织学、组织化学和免疫组化方法对所检查的组织进行评估,包括炎症(CD3、CD20、CD68)的存在和严重程度、神经纤维的结构(
)和血管的大小(CD34)。
结果OSAS 患者的中咽组织出现局部炎症过程(OSAS 患者的 CD3、CD20 和 CD68 表达更强)。CD3 免疫组化反应的强度与 OSAS 的严重程度相关。与打鼾者和对比组患者相比,OSAS 患者的纤维化程度更高,CD34 受体和 S-100 的表达也更高。
结论:打鼾通过长期的组织振动,很可能导致软腭部位的神经纤维受损,从而加剧睡眠中浅呼吸的发作,增加呼吸暂停的次数。
关键词: S-100 蛋白、CD20、CD3、CD34、打鼾、软腭、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征
缩略语表
AHI--呼吸暂停-低通气指数 HIF--低氧诱导因子 1 型 OSAS--阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 VEGF--血管内皮生长因子
引言
阻塞性睡眠呼吸暂停综合症(OSAS)是一种睡眠呼吸障碍,中年患者最常见[1]。阻塞性睡眠呼吸暂停综合征是一种睡眠呼吸障碍,最常见于中年患者[1]:通气不足、呼吸暂停、血氧饱和度降低和高碳酸血症[2]。在原发性打鼾的睡眠呼吸障碍患者中,可以观察到咽部口腔和喉部组织的振动。
反复缺氧是全身炎症发展的原因[3]。组胺、血清素、激肽、前列腺素和血栓素等炎症介质会被释放出来 [4]。细胞因子分泌的昼夜节律及其血液浓度都会发生改变 [5]。
白细胞系统的细胞从血液中迁移到受炎症影响的组织中[6]。在缺氧过程中,缺氧诱导因子 1 型(HIF-1)也会产生,从而引发炎症反应。HIF-1 是血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素基因转录的强效刺激因子。在 HIF-1 的作用下,血管生成和红细胞生成得到加强,从而对动脉血氧含量下降做出防御反应。CD34 蛋白是祖造血细胞的抗原。它存在于血管内皮细胞上。
组织中的炎症浸润可通过所检查组织中炎症细胞(T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞)的数量来评估。T 淋巴细胞的主要标志是 CD3 受体的表面结构域。相反,CD20 受体是 B 淋巴细胞的标记分子。由于长期打鼾导致组织振动,软腭部位的神经纤维很可能受到损伤,这可能会加剧睡眠中的浅呼吸发作,增加呼吸暂停的次数。神经末梢的结构可通过 S-100 蛋白的表达进行评估。
目标
该研究旨在评估从打鼾患者和有睡眠呼吸暂停症患者身上获取的软腭组织中的炎症、神经纤维和血管情况。
假设
打鼾会引起软腭组织振动,诱发局部炎症。
材料方法
研究对象包括成年患者,他们被分为两组:研究组和对比组。所有患者均接受过手术治疗。研究组的 22 名患者接受了注射软腭成形术,16 名患者接受了激光软腭成形术,8 名患者接受了中咽成形术。对比组患者接受了双侧扁桃体切除术,获得了腭舌弓的一部分。研究组患者的平均 AHI 为 14.9/h。
对手术中切除的腭悬雍垂和腭舌弓粘膜片段进行了组织学、组织化学和免疫组化评估。
研究小组分为以下三个分组:
G1 - 22 名习惯性打鼾且无睡眠呼吸暂停病史的患者。他们中没有人报告在白天出现以下情况:白天嗜睡、感到疲倦或需要小睡。测谎仪证实了原发性打鼾。睡眠参数在正常范围内。AHI 在 0.0 至 4 之间。该组患者的平均年龄为 44 岁,最大的 69 岁,最小的 29 岁;
G2 -16名患者主诉在睡眠过程中持续打鼾和呼吸暂停,他人也能观察到。根据睡眠检查结果,他们被诊断为轻度 OSAS。这组患者的平均年龄为 43 岁,最大的 75 岁,最小的 27 岁;
G1 和 G2 亚组患者的手术均在局部麻醉下进行:注射或激光软腭成形术。 3. G3 - 8名中重度OSAS综合征患者。测谎仪显示AHI
。受试者在全身麻醉下接受了手术:中咽成形术或扩展上咽括约肌成形术。AHI 在 16 到 35 之间。该组患者的平均年龄为 46 岁,最大的 57 岁,最小的 28 岁。
对比组(G0)由没有打鼾史或白天嗜睡史的患者组成。夜间陪伴患者的人没有发现患者在睡眠时呼吸暂停。对比组中的患者都曾因慢性腭扁桃体炎接受过手术。
图 1:研究组(G2)一名患者的黏膜片段。粘膜有强烈的炎症浸润(T 淋巴细胞)。大量细胞具有 CD3 受体表达特征(箭头)。免疫组化方法。放大 x200 倍。
他们没有报告任何并发症。我们对扁桃体切除术中提取的腭舌弓粘膜碎片进行了检查。
形态学评估方法
组织病理学检查包括纤维化和炎症浸润标准,具体标准如下。纤维化过程采用马森氏三色组织化学染色法进行评估:
(0)无纤维化组织区域、
(1) 局灶性纤维化(在 10 个有代表性的视野中,
以上但
以下的视野出现纤维化)、
(2) 弥漫性纤维化(10 个代表性视野中超过
个视野可见纤维化)。
免疫组化评估方法
为了评估炎症浸润,使用了针对 T 和 B 淋巴细胞以及巨噬细胞受体的免疫组化方法:CD3、CD20、CD68。CD34 抗原的表达可作为评估所研究组织中是否存在血管内皮的标志物。相反,S-100 蛋白的表达则表明存在神经纤维末梢。免疫组化研究使用的是安捷伦(DAKO)公司的抗体:
抗 CD3 蛋白的小鼠单克隆抗体,稀释度为 1:50(单克隆小鼠抗人 CD3,克隆 F7.2.38);
抗 CD20 蛋白的小鼠单克隆抗体,稀释度为 1:50(单克隆小鼠抗人 CD20,克隆 L26);
抗 CD34 蛋白的小鼠单克隆抗体,稀释度为 1:50(单克隆小鼠抗人,CD34 II 类,克隆 QBEnd 10);
稀释度为 1:50 的 S-100 蛋白兔多克隆抗体(代码 N1573,即用型 N 系列一抗);
单克隆小鼠抗人 CD68 蛋白抗体(克隆 PG-M1),浓度为 1:100。
获得的切片在恒温室中
脱石蜡 2 小时,然后在二甲苯中脱蜡,并在乙醇梯度(
)中水合。为了让针对被测蛋白质的抗体暴露抗原,组织在高 pH 值(pH 9.0)的 PT Link 中进行抗原暴露技术处理。然后在 Autostainer Link 系统(DAKO)中对切片进行染色。使用 FLEX/EnVision 显像试剂盒(DAKO)和 DAB(二氨基联苯胺)对抗原-抗体复合物进行显影。
使用放大到 x200 倍的光学显微镜对切片的免疫组化反应进行评估。
采用的评价量表如下
(0)无免疫组化反应--
以下细胞无表达或表达、
(1) 中度免疫组化反应--10%-30% 的细胞中有表达、
(2) 免疫组化反应强烈--在
以上细胞中表达。
对 CD34 和 S-100 蛋白表达的评估包括用 x40 和 x200 倍率的光学显微镜找出血管和神经末梢最 "丰富 "的区域(热点)。根据以下标准评估血管内皮标志物和作为神经末梢标志物的 S-100 蛋白在单个视野中的表达百分比、即使在非常细的血管(微血管)和神经末梢中的表达情况,以及
级的表达情况:
(0) 检查视野中 1-10% 的细胞有 CD34 和 S-100 表达、
(1) 检查视野中 10-30% 的细胞有 CD34 和 S-100 表达、
(2) 检查视野中超过 30% 的细胞表达 CD34 和 S-100。
然后对测试的 10 个视野的结果取平均值。
结果
研究的统计分析从比较研究组的年龄和 AHI 分布开始。从年龄和 AHI 的角度看,G1-G3 组的频率分布和区分足以进行进一步研究(尽管研究组人数较少)。研究结果表明,G1-G3 组之间的差异不具有统计学意义。
图 2.和图 3.受检组织的粘膜有强烈的炎症细胞浸润特征(箭头)。HE 染色。研究组(G3)一名患者的粘膜片段。放大 x200。 由于受试者的年龄,G1、G2、G3 分组之间存在差异(U-Mann-Whitney 检验 G 1 vs
vs
, G 2 vs
)。此外,还对研究组与因子得分之间的独立性进行了卡方检验。或然系数见表 I。
我们的结果显示,研究组与任何因子(
)之间都存在明显的统计关系。基于卡方检验的或然系数值描述了研究特征之间的关联强度,从 CD20 因子的 0.511 到 CD3 的 0.753 不等。CD3 受体表达与群体成员之间的关系最为密切(表达强度越大,疾病的严重程度越高)。在对比组和 G1 组的组织中发现的 T 淋巴细胞最少,而在 G3 组患者中发现的 T 淋巴细胞最多。CD20 受体表达与组别之间的关系最弱。
通过 Mann-Whitney U 检验,发现以下几组之间存在显著的统计学差异(
):G 1 组和 G 3 组对每个测试因子的评估;G 1 组和 G 2 组对五个因子的评估(CD20 因子除外,
);G 2 组和 G 3 组仅对 CD20 因子的评估
。
CD20 受体表达与组别之间的关系最弱。在睡眠呼吸障碍患者(G2 和 G3)的软腭组织中观察到了炎症反应(图 2 和图 3)。
采用对应分析法以图表形式显示研究组与两个选定因子得分之间的关系:CD3(最高或然因子值)和 CD20(最低或然因子值),采用了对应分析法[7]。对应分析图显示了组别成员如何区分每个因子的得分。与其他组相比,G0 组中 CD3 受体表达为 0、G1 为 1、G2 和 G3 为 2 的患者较多。 相反,与其他组相比,G1 组中 CD20 受体表达为 0、G1 和 G2 为 1 的患者较多(图 6 和图 7)。
根据所做的统计分析,得出以下结果:
CD3 表达越高,病症越严重。CD3 因子与疾病严重程度的关系最为密切;
与 G0(对比)、G1(原发性打鼾患者)和 G2(轻度 OSAS 患者)相比,G3(中重度 OSAS)患者的 CD20 受体表达更高。CD20 受体的表达与疾病主诉(打鼾、白天嗜睡)的严重程度相关性最小;
与原发性鼾症患者(G1 组)相比,OSAS 患者(G2 组和 G3 组)的 CD68 受体表达更高(图 4);
与轻度 OSAS 患者(G2 组)和原发性打鼾患者(G1 组)相比,中重度 OSAS 患者(G3 组)的 S-100 蛋白表达更高;
与对比组和原发性鼾症患者(G0 组和 G1 组)相比,OSAS 患者(G2 组和 G3 组)的纤维化程度更高(图 5);
与原发性打鼾患者(G1 组)相比,OSAS 患者(G2 组和 G3 组)的 CD34 蛋白表达更高。
讨论
睡眠呼吸障碍患者软腭组织的振动会导致炎症浸润的形成。软腭组织区域的主要炎症细胞是 T 淋巴细胞和巨噬细胞,在 AHI 超过 15 的患者中还会出现 B 淋巴细胞。Sekosan 的研究[8] 比较了 OSAS 患者与对照组(腭粘膜切片)的白细胞浸润情况。
图 4:具有大量巨噬细胞浸润特征的黏膜(膜上表达 CD68 蛋白,箭头)。研究组(G2)一名患者的粘膜片段。放大 x200 倍。
图 5.黏膜高度纤维化,出现大量胶原纤维(箭头)。一名 G3 组患者的粘膜片段。HE 染色。放大 x200 倍。
行点和列点
图 6 和图 7 应用对应分析的结果,显示了研究组与 CD3 和 CD2O 受体得分之间的关系(o 组表示 Go,I 组表示 G1,II 组表示 G2,III 组表示 G3)。 研究组的组织中含有更多的炎症细胞。)结果表明,研究组的组织含有较多的炎性细胞。Pulsen [9]对腭区的炎症浸润进行了分析,结果表明软腭粘膜中的大多数炎症细胞是 CD3 淋巴细胞,这与我们的研究结果一致。炎症细胞的出现很可能与睡眠时呼吸暂停导致的缺氧所释放的促炎因子水平升高有关[10]。炎症的严重程度与 OSAS 的严重程度相关。与轻度阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者相比,重度和中度阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者的局部炎症浸润程度更高。
AHI<5的打鼾患者有轻微的炎症反应。此外,在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者中还发现了全身性炎症。对促炎细胞因子 IL-6 和 TNF alpha 的研究证实,无论是成人还是儿童,OSAS 都会影响全身炎症的发生[11]。软腭组织的纤维化程度也存在明显的统计学差异。与未患 OSAS 的患者相比,OSAS 患者腭部组织的纤维化程度更高。Berger 等人[12]通过研究 OSAS 患者的软腭组织和从无睡眠呼吸障碍病史患者尸体上提取的软腭组织,发现在纤维化、炎症、水肿和血管扩张方面没有差异。
Woodson[13]使用电子显微镜显示软腭区域的神经纤维和神经细胞轴突脱髓鞘。我们的研究显示
表 I.测试结果的描述性统计(o 组表示围棋,I-G1,II-G2,III-G3)。
CZYNNIK
OCENA
O 组
。
GROUP IN
。
GROUP IIN
。
第 III 组
0
4
1
0
0
1
0
21
5
2
2
0
0
11
6
CD20
0
4
18
10
1
1
0
4
6
6
2
0
0
0
1
CD68
0
2
0
1
0
1
2
14
9
3
2
0
0
6
5
S-100
0
4
9
0
0
1
0
13
13
3
2
0
0
3
5
腺毛
0
4
17
0
0
1
0
5
8
4
2
0
0
8
4
CD34
0
2
4
0
0
1
2
18
6
4
2
0
0
10
4
S-100蛋白表达所显示的10个视野中神经末梢的密度与主诉疾病的严重程度之间存在相关性。Shah 等人[14]的研究也值得关注,他们发现阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者的神经纤维受损,其依据是 BDNF(一种属于神经生长因子家族的神经营养蛋白)水平的升高。本研究使用活组织切片采集悬雍垂区域的组织。软腭的长度和悬雍垂的大小会影响打鼾和职业性睡眠暂停的发生率。根据对多篇论文的分析,Chang 等人[15]定义了悬雍垂增大的参数--长度大于 15 毫米,宽度大于 10 毫米。悬雍垂的大小可能与打鼾时长期受到振动导致的组织肿胀有关[16]。在我们研究的组织中,我们观察到睡眠呼吸障碍患者的肿胀和血管扩张。
由于神经末梢受损,上气道对吸气负压的反应能力受损,阻塞性呼吸暂停的风险增加。软腭部位的运动神经受损会影响肌肉组织的反应和张力。肌肉纤维受损也可能导致睡眠时气道塌陷的风险增加。Shah 等人[17] 通过免疫组化研究发现,软腭部位肌肉细胞的细胞骨架存在异常。
帕特尔等人[18]在一篇分析了约 900 篇文献的论文中强调了神经病变导致腭悬雍垂和软腭张力丧失在 OSAS 中的作用,这也是疾病进展的原因之一。越来越多的研究以分析炎症过程、缺氧和睡眠呼吸障碍之间的关系为基础。Pena-Ortega [19] 强调有必要阐明这些过程之间的细胞机制。进一步的研究可能有助于更好地了解 OSAS 发生和发展的分子过程,并在将来发现 OSAS 的治疗点。
结 论
睡眠呼吸障碍患者的软腭组织会出现局部炎症过程。在所研究的因素中,主要由 T 淋巴细胞组成的炎症浸润与 OSAS 的严重程度关系最为密切。这意味着缺氧发作次数越多,软腭组织中积聚的 T 淋巴细胞就越多。OSAS 患者的局部炎症过程会导致该区域的血管通透性增加和组织肿胀。粘膜体积增大,加剧了睡眠呼吸障碍的阻塞机制。与轻度 OSAS 和原发性打鼾患者相比,中重度 OSAS 患者的 S-100 蛋白表达较高,这可能表明神经纤维受损,从而导致上气道对 "负 "吸气压力的反应受损。
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引用本文为:Panek J., Reszec J., Rogowski M., Olszewska E:Panek J.、Reszec J.、Rogowski M.、Olszewska E.:睡眠呼吸障碍患者软腭组织的组织学评估;Otolaryngol Pol 2020;74 (1):6-12