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杨刚强， 刘淑琪， 张晨， 俞丽萍， 邹宗吉， 王聪辉， 高萌，
李爽、马奕琪、徐若轩、宋志华、刘荣霞、王洪波*


引用： J. Med. Chem. 2023， 66， 8628-8642

摘要： P-糖蛋白（Pgp）的非底物变构抑制剂被认为是克服多药耐药性（MDR）的有前途的调节剂，但相对未知。在此，我们设计并合成了含有人肝产生的主要人参皂苷代谢物pyxinol的酰胺衍生物的氨基酸，并检查了它们的MDR逆转能力。鉴定出一种潜在的非底物抑制剂 （7a） 在核苷酸结合域处与 Pgp 的假定变构位点进行高亲和力结合。随后的测定证实， 它能够抑制基础和维拉帕米刺激的PgpATP酶活性（抑制率分别为87和 ），并且不能被Pgp泵出，表明它是一种罕见的非底物变构抑制剂。此外，7a 干扰了 Pgp 介导的 Rhodamine123 外排，同时对 Pgp 表现出高选择性。 值得注意的是，7a 还显着增强了紫杉醇的治疗效果，当用于治疗携带 KBV 异种移植肿瘤的裸鼠时，肿瘤抑制比为 。

 介绍


尽管近年来抗癌药物和相关治疗方法的开发取得了重大进展，但大多数转移性癌症患者最终还是死于与多药耐药性 （MDR） 相关的死亡率。 ATP 结合盒 转运蛋白被认为是 MDR 发展的主要贡献者，因为它们的外排功能可以降低各种结构无关的抗癌药物的细胞内浓度。 在 48 种已知的人类 转运蛋白中，P-糖蛋白 （Pgp 或 是一种 跨膜蛋白，由两个细胞质核苷酸结合域 （NBD） 和跨膜结构域 （TMD） 组成，可结合和转运各种化合物跨细胞膜，在各种肿瘤类型中广泛过表达。 Pgp 被认为是化疗最难治性癌症类型中 MDR 发作的重要介质，其上调与不良临床结果有关。 为了克服 Pgp 介导的 MDR，已经开发了分为三代的各种药物，目的是抑制 Pgp 外排功能。不幸的是，这些进入临床试验的抑制剂中的大多数最终都因反应不佳或内在毒性而被撤回。 这种毒性的一个潜在驱动因素是，大多数已知的 Pgp 抑制剂，包括维拉帕米 （ ）、tariquidar 和 zosuquidar，是 Pgp 的良好底物，可以刺激其基础 Pgp-ATP 酶活性，并且

导致需要相对较高的抑制剂浓度才能达到疗效，从而增加了脱靶毒性的风险。

收稿日期： 2023-02-16

出版日期： 2023年06月19日



Pyxinol 是一种来自人参的 ocotillol 型三萜类化合物（图 1），已被确定为人参的主要肝脏代谢产物

图 1.pyxinol衍生物和人参皂苷的化学结构。

 结果与讨论



方案 1.Pyxinol 酰胺衍生物的合成

方案 2.Pyxinol 酯衍生物的合成
2
13
15

表 1.Pyxinol 衍生物对 Ptx 诱导的 KBV 细胞毒性的影响

数据是平均值 标准差 化合物在 10 或 . 未确定。
数据是 10 或 10 处的平均 标准差 化合物。 未确定。

表 2.精选 Pyxinol 衍生物对 Ptx 诱导的 KBV 细胞毒性 的影响
治疗 反转折叠 治疗 反转折叠
PTX的 1 Vrp （英语） 64
22 82
21 67
36 46
56 321
61 130
21 49
35 11楼 209
塔里基达尔 113 塔里基达尔 150

表 3.选定的 Pyxinol 衍生物 的对接
复合 药物结合位点 （TMD） 推定变构部位 （NBD）  TPSA （英语：TPSA） Å 共识
-6.7 13 -8.1 1 723 117.1 6.81
-6.8 10 -8.5 0.6 573 90.8 4.99
-7.2 5 -8.6 0.5 575 104.8 5.30
-7.7 2 -9.3 0.1 623 104.8 5.30
-6.8 10 -6.4 21 747 143.4 6.31
-7.2 5 -7.6 3 723 117.1 6.80
11楼 -8.3 0.8 -8.0 1 795 126.3 7.60

表 4.7a对人Pgp 的ATP水解活性的影响
复合
刺激
ATP酶
DMSO公司
影响
刺激
ATP酶
基础ATP酶
DMSO）
影响
基底
ATP酶
DMSO公司
Vrp （英语） 刺激
7 安培 抑制剂 抑制剂

和 Pgp-Glo 测定（表 3 和 4）。这些结果证实了7a是Pgp的非底物抑制剂。


评估 7a 对 Pgp 介导的外排的影响。为了评估7a是否能够在原位抑制Pgp功能，Pgp介导的荧光罗丹明123


（Rh123）外排测定使用KBV细胞进行，如我们之前的报告所示。 衍生物 7 a 处理显著增加了 KBV 细胞内 Rh123 的积累 以剂量依赖性方式（图4A），Vrp也是如此，作为阳性对照。与KB细胞（一种Ptx敏感细胞系）相比，Ptx-C是一种与香豆素偶联的Ptx荧光衍生物，在KBV细胞中的积累明显减少（图4B）。这是因为 KBV 细胞可以通过 Pgp 介导的外排减少 Ptx 及其衍生物的细胞内积累，从而导致 Ptx 耐药性。有趣的是，这个过程可以通过7a逆转。观察到衍生物7a处理以剂量依赖性方式显着增加KBV细胞中的Ptx-C积累（图 and S3）.在7a浓度下 ，Ptx-C在KBV细胞中的积累几乎与KB细胞中的Ptx-C积累相同。我们进一步评估了对 KBV 细胞中 Pgp 蛋白水平和亚细胞定位的影响 ，但在 7a 处理后观察到这些水平和定位没有可测量的变化（图 5 和 S4），这表明 Pgp 表达及其亚细胞定位的变化与观察到的活性无关该化合物的活性。总之，这些发现表明， 通过增加 Ptx 的细胞内积累并通过直接抑制 Pgp 外排功能来抑制其 Pgp 介导的外排，从而逆转 KBV 细胞中的 Ptx 耐药性。
（Rh123）外排测定使用KBV细胞进行，如我们之前的报告所示。 衍生物7a处理以剂量依赖性方式显着增加KBV细胞 内Rh123的积累（图4A），作为阳性对照的Vrp也是如此。与KB细胞（一种Ptx敏感细胞系）相比，Ptx-C是一种与香豆素偶联的Ptx荧光衍生物，在KBV细胞中的积累明显减少（图4B）。这是因为 KBV 细胞可以通过 Pgp 介导的外排减少 Ptx 及其衍生物的细胞内积累，从而导致 Ptx 耐药性。有趣的是，这个过程可以通过7a逆转。观察到衍生物 7a 处理以剂量依赖性方式显着增加 KBV 细胞中 Ptx-C 的积累（图 和 S3）。在7a浓度下 ，Ptx-C在KBV细胞中的积累几乎与KB细胞中的Ptx-C积累相同。我们进一步评估了对 KBV 细胞中 Pgp 蛋白水平和亚细胞定位的影响 ，但在 7a 处理后观察到这些水平和定位没有可测量的变化（图 5 和 S4），这表明 Pgp 表达及其亚细胞定位的变化与观察到的活性无关该化合物的活性。总之，这些发现表明， 通过增加 Ptx 的细胞内积累并通过直接抑制 Pgp 外排功能来抑制其 Pgp 介导的外排，从而逆转 KBV 细胞中的 Ptx 耐药性。
Analysis of 7a Selectivity for Pgp. Pgp and MDRassociated protein 1 (MRP1 or ) are the primary proteins thought to be involved in MDR phenotypes, and all are
Figure 5. Effects of 7a on Pgp protein expression (A) and subcellular localization (B). Following treatment with 7a, Pgp levels in KBV cells were assessed via western blotting (A) and immunofluorescence (B) assay. Dapi (blue) indicates the nuclei. Scale bar: .
overexpressed by KBV cells. Notably, most known Pgp modulators have been found to inhibit to varying extents due to the similarities in both structure and function between Pgp and ABCC1. Thus, the selectivity of was examined by assessing its capacity to sensitize KBV cells to exporter-mediated anticancer agents. As shown in Tables 2 and 5, derivative 7a markedly sensitized MDR cells to the Pgp substrates adriamycin and Ptx, where it failed to sensitize KBV
Table 5. Assessment of the Selectivity of as an Inhibitor of ABC Transporters Overexpressed in KBV Cells
treatment  反转折叠
adriamycin 1.0
8.0
15.8
Vrp 13.2
cisplatin 1.0
1.0
1.0
MK571 3.6
Data are mean .
cells to cisplatin, a nonsubstrate of Pgp. However, MK571, a specific inhibitor, could robustly sensitize KBV cells to cisplatin (Table 5), consistent with the observation that ABCC1 is involved in cisplatin resistance. These data suggest that selectively inhibits Pgp efflux activity.
Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). A CETSA approach was next used to assess the binding affinity of with in situ Pgp as this label-free method can enable efficient analyses of protein-compound interactions in physiological environments. Briefly, live KBV cells were incubated with followed by thermal denaturation at different temperatures. Cell lysate soluble fractions were then collected and evaluated following freeze-thaw cycles. The binding of a protein to a given compound can increase its overall resistance to denaturation such that it may remain stable in the soluble lysate fraction at a higher temperature relative to the unbound protein. Indeed, treatment with stabilized Pgp at higher temperatures compared with DMSO treatment, but not ABCC1 (Figures 6
和S5），与选择性抑制试验的结果一致（表5）。这些数据强烈表明 Pgp 是 并且这种结合涉及其 MDR 逆转活动。
7a 对 Ptx 介导的细胞周期停滞的影响。接下来使用流式细胞术来评估 Ptx介导的KBV细胞的细胞周期停滞和随之而来的细胞凋亡。与对照组相比，在单独用7 a处理的细胞中未观察到细胞周期进程或细胞凋亡的明显变化（图7）。同样，由于 KBV 细胞的 MDR 状态，单独 Ptx 处理未能影响这些活性。然而 Ptx 联合治疗与细胞停滞增加相关 阶段 ，并且细胞凋亡的发生率显着增加，这表现为亚凋亡频率的增加。 这些发现共同表明，7a 逆转了 MDR 细胞中的 Ptx 耐药性，而不影响 Ptx 诱导的细胞凋亡。
7a治疗对肿瘤化学敏感性的体内影响评估。鉴于 7a 通过对 Pgp 的非底物变构抑制作为 MDR 逆转剂的强大能力，对 CYP3A4 活性没有明显影响（数据未显示），我们接下来评估了其在携带 KBV 肿瘤异种移植物的裸鼠体内逆转化疗耐药性的能力。在有或没有 Ptx 的 7a 治疗后，在治疗期间每 3 天监测一次肿瘤体积，并在实验结束时称量肿瘤。正如预期的那样，KBV肿瘤对Ptx治疗具有耐药性 ），因此Ptx组和载体对照组之间的肿瘤进展没有明显差异，这与我们的体外结果一致（图8）。与 7a （20 ），然而，与 Ptx 介导的肿瘤生长的显着抑制有关 ，抑制比高达 没有伴随任何毒性的增加。相比之下，单独的7 a对肿瘤生长没有影响。这些结果表明，在耐受剂量下，7 a可以在体内有效地恢复Ptx对MDR人肿瘤的敏感性。

结论

Pyxinol 衍生物作为可能的 MDR 逆转剂已被广泛研究， 先前的证据表明，pyxinol 衍生物与 Pgp 的 TMD 结合，从而调节其外排活性。 在此，我们合成了一系列带有氨基酸残基的pyxinol酰胺衍生物，并取得了很高的收率。使用KBV细胞探索了这些化合物在体外逆转Ptx耐药性的能力，并根据所得数据预测了可能的构效关系。值得注意的是，分子对接分析表明，衍生物 7a 可能优先结合 Pgp NBD 内的推定变构位点，而不是位于 Pgp TMD 中的药物结合位点。与分子对接分析的预测一致，随后的 Pgp-Glo 测定证实 7 a 能够在工作浓度下强烈抑制基础和刺激的 Pgp-ATP 酶活性。这种抑制模式通常是由Pgp的非底物变构抑制引起的。 CETSA方法进一步证实，7a可以直接与Pgp相互作用，但不能与另一个相互作用 出口商就地。其他机理分析表明， 能够选择性地抑制 Pgp 介导的药物外排，并且其 MDR 逆转能力不归因于 Pgp 蛋白表达的降低，而是其功能抑制。因此，衍生物 7a 通过将细胞周期停滞在 阶段，导致 Ptx 诱导细胞凋亡。
本研究为天然产物Pgp非底物变构抑制剂的开发提供了新的方向。所选化合物 被证实可作为潜在的非底物变构抑制剂。因此， 在裸鼠中，Ptx对KBV细胞异种移植物的抗肿瘤活性大大增加，而没有任何额外的毒性。因此，我们的结果表明，7a可能作为一种新型的有前途的先导化合物，用于治疗Pgp介导的MDR。显然，需要进一步的研究来充分探索确切的结合位点，并开发更有效的非底物变构抑制剂来抵消Pgp介导的MDR。


图7.7a 对 Ptx 介导的 KBV 细胞周期进程变化的影响。通过流式细胞术评估细胞 用指定的化合物进行后处理。
图8.评估 7a 对携带 Ptx 耐 Ptx 的 KBV 异种移植肿瘤小鼠中 Ptx 抗癌功效的影响。测量 KBV 细胞植入后体重 （A） 和肿瘤体积 （B） 的变化。在植入后第 23 天采集肿瘤、成像 （C） 并称重 （D）。数据是平均值 ，与控制。

实验部分


化学。材料和溶剂从商业供应商处获得，并酌情进一步干燥。 用JEOL ECA400波谱仪（日本）测量 核磁共振波谱，使用四甲基硅烷（TMS， ）作为内标，单位 为 ppm。分别使用SGW-3光谱仪（中国）、Waters ACQUITY UPLC（或Waters e2695）和Thermo Scientific QExactive质谱仪评估旋光度、纯度和高分辨率质谱（HRMS）。所有最终化合物都是 纯的（Waters色谱柱，C18， ，流速 ，或XBridge C18， ，流速 ）。

和 .制备了关键中间体1、2、5和10，并按照我们公布的程序通过重结晶进一步纯化。 和 的 合成方法如下所述。在含有关键中间体（ 或 ）和 -Boc氨基酸 的溶液中加入无水DMF 和 Ar。将溶液在室温（RT）下搅拌， 然后通过加水终止反应。将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，干燥 ，浓缩，并用硅胶柱层析纯化，得到化合物 。

TFA 被添加到化合物 中， 或 在 。将溶液在室温下搅拌， 然后将溶液真空浓缩六次， 生成化合物 。

（20S，24R）-环氧-3 -N-（N-叔丁氧羰基-L-脯氨酰基）-达马烷-12 ，25 二醇 （6a）。收率： 90%; （ C 1.0， ， ， ， 核 磁共振 、49.4、47.9、47.1、39.7、39.3、38.6、37.9、37.0、34.7、32.6、31.2、31.2、28.5、28.3（5C）、27.9、27.6、26.1、25.6、25.0、18.5、18.1、16.2（2C）、15.3。人力资源管理系统 （ESI） 钙化 673.5150，找到 673.5161。