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西地那非改善雄性大鼠幼崽新生儿缺氧缺血后的海马脑损伤并恢复神经元发育
1,2关联数据
抽象
海马体是大脑的基本结构，在神经发育中起着重要作用，对缺氧缺血 （HI） 非常敏感。本研究的目的是调查西地那非对 HI 导致的新生儿海马脑损伤的影响，以及在这种情况下对神经元发育的影响。在出生后第 10 天 （P10） 通过左颈总动脉结扎，然后暴露于 8% 氧气 2 小时，在雄性 Long-Evans 大鼠幼崽中诱导 HI。大鼠幼崽随机接受赋形剂或西地那非口服，每天两次，持续 7 天，从 HI 后 12 小时开始。在 P30 进行苏木精和伊红染色以测量海马体表面;进行免疫组化对海马体中的神经元、少突胶质细胞和神经胶质细胞进行染色。在 P12 、 P17 和 P30 进行海马 Western 印迹，研究神经元标志物和 mTOR 通路的表达。HI 引起显着的海马萎缩和成熟神经元数量的显着减少，并诱导海马反应性星形细胞增多症和小胶质细胞增生。HI 增加细胞凋亡并导致正常神经元发育程序的显着失调。西地那非治疗保留了海马体的大体形态，将成熟神经元的数量恢复到与假大鼠相当的水平，显着增加了未成熟和成熟的少突胶质细胞，并显着减少了小胶质细胞和星形胶质细胞的数量。西地那非还减少了细胞凋亡并重建了出生后神经元发育的正常进展。PI3K/Akt/mTOR 通路可能涉及，其活性在海马 HI 后降低，并在西地那非治疗后恢复。西地那非在 HI 后的新生海马体中可能同时具有神经保护和神经恢复特性。
介绍
新生儿缺氧缺血 （HI） 导致广泛的脑损伤。靶向 HI 后新生儿大脑的内源性神经恢复能力可能会改善受影响新生儿的长期神经系统结局。众所周知，出生后人脑可以通过在侧脑室下区和海马齿状回 （DG） 的颗粒下区 （SGZ） 中发现的神经干细胞的增殖产生新的神经元和少突胶质细胞1–3.神经发生和少突胶质细胞生成等内源性修复机制的激活可能代表一个创新的治疗靶点1–4.海马体是 HI 后内源性修复过程的重要部位，因为由于海马亚颗粒区 （SGZ） 中存在神经干细胞，因此在出生后会继续产生新的神经元。雷帕霉素的哺乳动物靶标 （mTOR） 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是参与促进 NSC 转变为成熟神经元的已确定通路之一11,40.其失调与神经祖细胞失衡有关，从而导致严重的神经功能缺损，如自闭症、癫痫和神经退行性疾病47.发育中的海马体对学习和记忆很重要5.海马体是一个高度活跃的大脑代谢区域，对氧气的需求很高6，因此它是缺氧缺血性损伤的重要靶标7.西地那非是 5 型磷酸二酯酶 （PDE5） 的选择性抑制剂，已被证明通过增加神经元数量，有助于修复足月等效年龄 HI 引起的皮质和视网膜损伤8,9.以前的研究还表明，西地那非可改善老年和年轻大鼠 HI 模型的皮质脑损伤4,10–12.然而，这种治疗对新生儿海马体的影响尚未得到评估。此外，西地那非对受伤新生儿大脑神经元发育的影响以前没有研究过。
因此，本研究的目的是调查西地那非对足月等效年龄 HI 后新生儿海马脑损伤的影响，并探讨这种治疗在这种情况下对神经元和 mTOR 通路的作用。我们假设西地那非可能具有神经保护作用和神经恢复作用，可以改善海马脑损伤。
结果
HI 减少海马损伤后西地那非治疗
与对侧海马体相比，HI 显着减小了 P30 处同侧海马体的大小（图 .1与用载体处理的假手术大鼠相比，用载体处理的 HI 大鼠幼崴的同侧和对侧海马表面之间的比率显著降低 （p < 0.001）（图 D）。1B）. 所有剂量的西地那非治疗均显示同侧海马体的大体解剖结构有所改善（图 D）。1所有西地那非剂量均将同侧和对侧海马表面之间的比率增加到与假大鼠差异不显著的水平。
用载体或西地那非治疗的假大鼠和 HI 大鼠的苏木精和伊红染色冠状脑切片。（A） 代表性的苏木精和伊红染色的冠状脑切片，显示同侧海马体。（B） 同侧/对侧海马表面比值（具有单个数据点表示的中位数）。显著性：来自 Kruskal-Wallis 检验的 p 值，与 Dunn 事后比较检验：**p < 0.01，***p < 0.001。动物数量：n = 10 只用载体 （假载体） 处理的假大鼠，8 只用载体 （HI 载体） 处理的 HI 大鼠，9 只用低剂量 （2 mg/kg） 西地那非 （HI 2 mg/kg） 处理的 HI 大鼠，9 只用中等剂量 （10 mg/kg） 的西地那非 （HI 10 mg/kg） 处理的 HI 大鼠 （HI 50 mg/kg） 和9只用高剂量 （10 mg/kg） 的西地那非 （HI 50 mg/kg） 处理。
HI 后西地那非治疗保留了海马体中的神经元计数
HI 导致同侧海马 DG 和 CA1 区 P30 处成熟 （NeuN+） 神经元的数量显著减少（图 D）。2A，B） （p < 0.01） 与假大鼠相比。用载体治疗的 HI 大鼠同侧海马体 CA3 区的成熟神经元数量也趋于减少，但与假大鼠相比，这个数字没有达到统计学意义。
用载体或西地那非治疗的假大鼠和 HI 大鼠成熟神经元的免疫染色。对海马体 3 个区域的细胞进行计数：即同侧海马体的齿状回 （DG） 、 CA1 和 CA3 区域。（A） 海马同侧 DG 区用 NeuN 标记的成熟神经元的代表性免疫荧光显微照片。（B） DG、CA1 和 CA3 中用 NeuN（具有单个数据点表示的中位数）标记的成熟神经元细胞。显著性：来自 Kruskal-Wallis 检验的 p 值，与 Dunn 事后比较检验：**p < 0.01。动物数量：n = 7 假载体、3 HI 载体、8 HI 2 mg/kg、9 HI 10 mg/kg 和 8 HI 50 mg/kg。
与假大鼠相比，所有剂量的西地那非都将 DG 中成熟神经元的数量恢复到不再显着差异的水平（图 D）。2A，B）。此外，中剂量 （10 mg/kg） 和高剂量 （50 mg/kg） 的西地那非将 CA1 区成熟神经元的数量恢复到与假大鼠相比不再显着差异的水平。
HI 后西地那非治疗减少了细胞凋亡并逐渐恢复了海马体的正常神经元发育程序
HI 后，与假大鼠相比，同侧海马体中早期和晚期神经元发育标志物的表达显著降低。HI 导致性别决定区 Y-box 2 （Sox2） 蛋白在 P12 （p < 0.05） 和 P17 （p < 0.05） 的表达显著降低，但在 P30 时没有降低（图 .3HI 还导致 P12 （p < 0.01）、P17 （p < 0.05） 和 P30 （p < 0.05） 的巢蛋白表达显著降低（图 D）。3HI 导致 P12 （p < 0.01）、P17 （p < 0.05） 和 P30 （p < 0.05） 的双皮质素 （DCX） 表达显著降低（图 .3HI 导致 P12 （p < 0.01）、P17 （p < 0.05） 和 P30 （p < 0.05） 的 NeuN 表达显著降低（图3HI 导致钙调蛋白在 P17 处显著降低 （p < 0.05），并且在 P30 处也降低了其表达，但在该时间点未达到统计学意义（图 D）。3E);此外，各组之间在 P12 处没有差异（图 D）。3HI 还导致钙结合蛋白在 P30 处显著降低 （p < 0.05），但 P12 和 P17 没有降低（图3此外，与假大鼠相比，HI 导致同侧海马 P12 处裂解的 PARP 显着增加 （p < 0.05） （图 .3G);此外，裂解的多聚 ADP 核糖聚合酶 （PARP） 的表达在 P17 和 P30 处组间没有差异。HI 在 P12 处降低了 GAP-43，但在该时间点未达到统计学意义;HI 还导致 P17 和 P30 处的 GAP-43 显着降低 （p < 0.05）（图 D）。3H).
用载体或西地那非处理的假大鼠和 HI 大鼠幼崽的早期/晚期神经元发育、细胞凋亡和同侧海马轴突再生的标志物的蛋白质印迹。具有单个数据点表示的中位数，带有裁剪的代表性蛋白质印迹。全长印迹以补充材料.（A） 袜子2.（B） 巢。（C） 双皮质素 （DCX）。（D） NeuN.（E） 钙调蛋白。（F） 钙结合蛋白。（G） 劈裂的 PARP。（H） GAP-43 的。显著性：来自 Kruskal-Wallis 检验的 p 值，与 Dunn 事后比较检验：*p < 0.05，**p < 0.01。动物数量：n = 6、8 和 7 假载体，6、8 和 7 HI 载体，以及 7、8 和 10 HI 50 mg/kg，分别在 P12、P17 和 P30。
西地那非治疗将早期和晚期神经元发育标志物的表达恢复到与假大鼠不再显着差异的水平。Sox2 表达在 P12 和 P17 与假大鼠没有显著差异（图3A）. 巢蛋白 （图 .3B）、DCX（图 D）。3c） 和 NeuN （图 .3D） 在 P12 、 P17 和 P30 的表达不再与假大鼠有显著差异。钙调蛋白表达在 P17 和 P30 时与假大鼠没有显着差异，并且在这些相同时间点与用载体处理的 HI 大鼠相比显着增加 （p < 0.05）（图3钙结合蛋白表达在 P30 时与假大鼠没有显著差异，并且在同一时间点与 HI 大鼠相比显著增加 （p < 0.05）（图 D）。3F）. 西地那非治疗将裂解的 PARP 水平恢复到与 P12 假大鼠没有显着差异的水平（图 D）。3GAP-43 表达在 P17 时与假大鼠没有显著差异，在 P12 时与 HI 大鼠相比显著增加 （p < 0.05）（图 D）。3H).
HI 后西地那非治疗增加了海马体的少突胶质生成
当更具体地通过 P30 的免疫组织化学观察时，我们发现与假大鼠相比，HI 导致同侧海马 DG 中未成熟 （Olig2+） 少突胶质细胞的数量显着增加 （p < 0.05）（图 .4A，B）。在 CA1 和 CA3 区域，我们发现用载体治疗的 HI 大鼠中未成熟少突胶质细胞的数量有增加的趋势，尽管与假大鼠相比，这种趋势没有达到统计学意义。用载体处理的 HI 大鼠同侧海马体 DG、CA1 和 CA3 区域中成熟 CC1 + 少突胶质细胞的数量与假大鼠的数量没有差异（图 D）。4A，C）。
用载体或西地那非处理的假大鼠和 HI 大鼠幼崽中少突胶质细胞的免疫染色。对海马体 3 个区域的细胞进行计数：即同侧海马体的齿状回、CA1 和 CA3 区域。（A） 海马同侧 CA3 区域中用 Olig2 标记的未成熟少突胶质细胞和用 CC1 标记的成熟少突胶质细胞的代表性免疫荧光显微照片。（B） 用 Olig2 标记的未成熟少突胶质细胞，以及 （C） 用 CC1 标记的成熟少突胶质细胞（具有单个数据点表示的中位数）。显著性：来自 Kruskal-Wallis 检验的 p 值，与 Dunn 事后比较检验：*p < 0.05，**p < 0.01。动物数量：n = 8 假载体、6 HI 载体、7 HI 2 mg/kg、9 HI 10 mg/kg 和 8 HI 50 mg/kg。
与假大鼠相比，用低剂量 （2 mg/kg） 西地那非和高剂量西地那非治疗的 HI 大鼠的 DG 区未成熟 Olig2 + 少突胶质细胞的数量显着增加。高剂量西地那非还显着增加了 CA1 和 CA3 区未成熟 （Olig2+） 少突胶质细胞的数量（图 D）。4A，B） （p < 0.05） 与假大鼠相比。此外，与假大鼠相比，高剂量西地那非增加了 CA1 （p < 0.01） 和 CA3 （CA3： p < 0.05） 区域的成熟 CC1+ 少突胶质细胞的数量（图 .4A，C）;我们在 DG 领域观察到类似的趋势，但组间差异不显著。
HI 后西地那非治疗减少了海马体中炎症细胞的数量
HI 导致同侧海马体 DG （p < 0.001）、CA1 （p < 0.05） 和 CA3 （p < 0.05） 区域中 GFAP+ 星形胶质细胞的数量显着增加（图 .5A，B） 与假大鼠相比。HI 还导致 DG （p < 0.0001）、CA1 （p < 0.0001） 和 CA3 （p < 0.05） 区域中 Iba1 + 小胶质细胞的数量显着增加（图 .5A，C） 与假大鼠相比。
用载体或西地那非处理的假大鼠和 HI 大鼠幼崽中星形胶质细胞和小胶质细胞的免疫染色。对海马体 3 个区域的细胞进行计数：即同侧海马体的齿状回、CA1 和 CA3 区域。（A） 同侧齿状回中用 GFAP 标记的星形胶质细胞和用 Iba1 标记的活化小胶质细胞的代表性免疫荧光显微照片。（B） 用 GFAP 标记的星形胶质细胞，以及 （C） 用 Iba1 标记的活化小胶质细胞（具有单个数据点表示的中位数）。显著性：来自 Kruskal-Wallis 检验的 p 值，与 Dunn 事后比较检验：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。动物数量：n = 8 假载体、4 HI 载体、8 HI 2 mg/kg、9 HI 10 mg/kg 和 8 HI 50 mg/kg。
西地那非治疗减少了同侧海马体的星形胶质增多症。在海马体的三个区域，所有剂量的西地那非都将星形胶质细胞的数量减少到与假大鼠没有显着差异的水平（图 D）。5A，B）。在所有三个区域中，与载体治疗的 HI 大鼠相比，用高剂量西地那非治疗的 HI 大鼠的星形胶质细胞数量显着降低 （DG 和 CA1 的 p < 0.05，CA3 的 p < 0.01）。此外，西地那非治疗减少了小胶质细胞增生。在 DG 中，中等剂量的西地那非将活动性小胶质细胞增生降低到与假大鼠无显著差异的水平;低剂量和高剂量西地那非也减少了小胶质细胞增生，但与假大鼠相比，小胶质细胞的数量仍然显着更高（分别为 P < 0.01;P < 0.05）（图 .5A，C）。在 CA1 区，中剂量和高剂量的西地那非均将活动性小胶质细胞增生降低到与假大鼠无差异的水平。关于低剂量西地那非，小胶质细胞的数量减少，但仍然显著高于我们在假大鼠中观察到的水平 （p < 0.01）。在 CA3 区域，所有剂量的西地那非将活动性小胶质细胞增生降低到与假大鼠无差异的水平。
HI 降低了海马中 Pl3kAKT/mTOR 通路的活性，而西地那非避免了这种作用
与假大鼠相比，HI 后两天 （P12） p-AKT 水平显着下降 （p < 0.05）（图 .6A），它与 mTORC1（丝氨酸 2448）水平的显着降低有关 （p < 0.05）（图6B） 和 mTORC2（丝氨酸 2481）（p < 0.01）（图 D）。6p17 时 mTORC1 （丝氨酸 2448） 水平保持显著降低 （p < 0.01），而 p-AKT 和 mTORC2 （丝氨酸 2481） 水平在组间没有差异。在 P30 处没有显著差异。
西地那非治疗将 P12 的 p-AKT、mTORC1（丝氨酸 2448）和 mTORC2（丝氨酸 2481）的水平恢复到与假大鼠没有显着差异的水平（图 D）。6A-C）。在 P17 和 P30，与在这些相同时间点用载体处理的 HI 大鼠相比，用西地那非治疗的 HI 大鼠的 p-AKT 水平显着增加 （p < P17 为 0.01，p < P30 为 0.05）。
讨论
海马萎缩是新生儿 HI 后 20 天脑损伤的特征，与成熟神经元数量减少、未成熟少突胶质细胞数量增加以及小胶质细胞和星形胶质细胞数量增加有关。类似的海马萎缩先前在新生儿 HI 的动物模型中也有描述13,14，并且与患有新生儿脑病的人类足月新生儿的学习和记忆长期损害有关15,16.HI 还降低了早期神经元标志物和晚期/成熟神经元标志物的表达水平，这表明从 NSCs 到成熟神经元的正常神经元发育存在障碍，并可能解释这些新生儿遇到的一些长期神经发育并发症。此外，HI 增加了裂解的 PARP，这表明 HI 后 caspase 介导的凋亡细胞死亡增加，而 GAP-43 降低，表明 HI 后轴突也受伤17.
西地那非治疗在 HI 后 12 小时开始并持续 7 天以防止这种海马萎缩（图 D）。7).该治疗导致新生儿海马体 HI 后成熟神经元的数量增加至与假大鼠无差别的水平。一方面，西地那非似乎通过减少损伤次级阶段的细胞凋亡，从而减少脑损伤急性期海马体的神经元丢失，对神经元群具有神经保护作用。西地那非的抗凋亡特性先前已在多发性硬化症的小鼠模型中得到证实18.另一方面，西地那非似乎在 HI 后通过激活损伤急性至慢性期的神经元祖细胞而具有神经恢复特性，从而促进损伤第三期的神经发生和神经恢复。西地那非治疗将早期神经元标志物（Sox2、Nestin 和 DCX）的水平提高到与 P12 假大鼠无异的水平，这表明神经祖细胞群和神经母细胞在仅 4 剂西地那非后就已经恢复。P12 细胞凋亡的减少也有可能为这些神经祖细胞群提供神经保护19.主要在齿状回 P10-P12 之间发现的神经祖细胞和神经母细胞特别容易受到凋亡性损伤20,21.西地那非已被证明可显着增加中年小鼠缺血脑中巢蛋白的表达22.已知源自脑室下区的表达巢蛋白的成体祖细胞对 PDE5 具有免疫反应23.西地那非已被证明可以通过显着增加脑室下区和纹状体中表达 DCX 的未成熟神经元的数量来改善大脑中动脉闭塞后 28 天年轻大鼠的功能恢复4.有趣的是，即使在局灶性脑缺血后 7 天开始延迟西地那非治疗也被发现会增加老年大鼠 （3 个月） 的 DCX 表达，从而导致功能恢复24.已发现西地那非通过增强嗜神经支持和增加脑源性神经营养因子 （BDNF） 的水平来促进神经母细胞成熟为海马体中的颗粒细胞25.
调查结果摘要。HI 引起显着的海马萎缩和成熟神经元数量的显着减少，并诱导海马反应性星形细胞增多症和小胶质细胞增生。HI 增加细胞凋亡并导致正常神经元发育程序的显着失调。西地那非治疗保留了海马体的大体形态，将成熟神经元的数量恢复到与假大鼠相当的水平，显着增加了未成熟和成熟的少突胶质细胞，并显着减少了小胶质细胞和星形胶质细胞的数量。西地那非还减少了细胞凋亡并重建了出生后神经元发育的正常进展。PI3K/Akt/mTOR 通路可能涉及，其活性在海马 HI 后降低，并在西地那非治疗后恢复。西地那非在 HI 后的新生海马体中可能同时具有神经保护和神经恢复特性。
在我们的新生儿缺氧缺血大鼠模型中，我们发现 HI 后西地那非治疗后 P12 和 P17 的早期神经元祖细胞标志物增加，但受伤海马体 P30 处的晚期/成熟神经元标志物也有增加。这种增加解释了免疫组化测量的 NeuN 阳性细胞数量的增加，这可能导致海马体大体形态保持在 P30。西地那非已被证明通过增加用皮下西地那非治疗 7 天的中年大鼠中成熟 NeuN 表达神经元的分数来增强神经元分化，从大脑中动脉闭塞后 1 天开始22.已知西地那非可穿过血脑屏障，并通过抑制神经元和神经胶质细胞中的 PDE5 来增加环磷酸鸟苷 （cGMP） 的水平26.cGMP 水平升高也被认为通过刺激神经干细胞 （NSC） 和神经祖细胞 （NPS） 的增殖和分化来直接影响信号通路，从而增强神经发生23.与神经胶质细胞相比，妊娠期间高水平的 cGMP 与神经干细胞优先分化为神经元相关27.在我们的研究中，西地那非治疗似乎通过促进正常的大脑发育来逆转 HI 的效果，但它并没有增加超过假水平的神经发生。西地那非治疗后，在梗死边界区附近的同一动物模型的皮层中发现成熟神经元的类似增加8，并且新的神经元可能在缺血性脑损伤后从海马体迁移到皮层28.有趣的是，神经发生的激活与 GAP-43 的增加有关，GAP-43 是一种已知在轴突重塑和损伤后突触再生期间增加的蛋白质17,28.需要进一步的工作来了解西地那非对 HI 后新生儿大脑突触形成和可塑性的潜在作用。
在我们的研究中，西地那非治疗还增加了未成熟和成熟少突胶质细胞的数量。与神经元类似，少突胶质细胞已被证明在 HI 后的神经恢复中起着至关重要的作用29.尽管少突胶质细胞在中枢神经系统中极易受到 HI 损伤，但 HI 最初也为它们提供增殖信号以启动修复30.有趣的是，在我们的研究中，我们观察到用载体治疗的 HI 大鼠齿状回中未成熟的少突胶质细胞增加，这表明内源性修复过程被激活。然而，在海马体的其他区域没有观察到这种增加，并且与成熟少突胶质细胞的增加无关，这可能表明这些细胞，即使它们最初可能已经被激活，如果没有额外的帮助，也不会产生功能性少突胶质生成。西地那非治疗可能会增强内在修复机制，并可能导致 HI 后白质损伤的修复。西地那非已被证明可以增加周围神经系统中的髓鞘厚度，从而改善成年糖尿病小鼠的周围神经病变31.西地那非还被发现通过扩增表达巢蛋白的神经干细胞来增加中年小鼠缺血脑中的少突胶质细胞后代22.进一步的研究应更详细地调查 HI 和西地那非治疗后这些动物的白质。
我们在西地那非治疗后观察到的神经发生和少突胶质发生与 HI 后 20 天炎症细胞的减少有关。虽然急性神经炎症可能是新生儿 HI 后可能在海马体中激活的内源性修复试验的一部分，但慢性和持续性神经炎症通常与神经发育测试表现不佳有关14.已知慢性和持续性神经炎症是通过轴突和髓鞘变性导致白质损伤的有效因素32.在我们的研究中，海马胶质增生是一个持续性特征，在 HI 后 20 天仍然很明显。HI 后反应性星形细胞增多症和活化的小胶质细胞增生在海马体上很明显，西地那非治疗显着减少了整个海马体的星形细胞增多症和活化的小胶质细胞增生。减少小胶质细胞增生已被证明有助于降低新生儿 HI 啮齿动物模型中皮质和海马损伤的严重程度33.减少反应性星形红细胞增多症可能会减少炎性细胞因子的释放33.损伤第三期神经炎症的减少可能会为神经再生创造更健康的神经元生态位，因此需要在西地那非给药后新生儿 HI 模型中进一步研究。
西地那非的神经保护、神经修复和抗炎作用机制在新生 HI 大鼠模型中仍有待阐明。可能参与这些有益作用的可能分子通路是 PI3K/Akt/mTOR 通路，已知其激活可增加神经发生、调节髓鞘形成并影响神经炎症11,34–36.mTOR 由两个功能不同的复合物组成37.活性 mTOR 复合物 1 （mTORC1） 促进 NSC 的成熟和存活，增加细胞增殖，并抑制细胞凋亡38.活性 mTORC2 促进细胞存活，并增强神经元和少突胶质细胞分化39–41.在我们的研究中，HI 显著降低了海马体中磷酸化 AKT 、 mTORC1 和 mTORC2 的水平，而西地那非治疗将其水平恢复到与假大鼠无显著差异的水平。西地那非诱导的细胞内 cGMP 水平增加激活 PI3K，PI3K 通过磷酸化激活 AKT。西地那非已被证明通过增加雄性 Wistar 成年大鼠的 AKT 和糖原合酶激酶 3 （GSK-3） 磷酸化来增加 SVZ 细胞增殖42.p-AKT 的增加通过保护神经元免受皮质、海马和运动神经元培养物中的凋亡来赋予神经保护作用43.AKT 通路还增强了小鼠胚胎干细胞 （ESC） 中 Sox2 的稳定性和活性，这对 NSC 的自我更新和多能性品质至关重要44.p-AKT 表达的增加导致 mTORC1 水平增加，这已被证明对成人和衰老前脑中的 NSC 分化至关重要45，以及小鼠短暂性局灶性脑缺血后的神经元存活46.因此，Pl3K/AKT/mTOR 通路的失调可能解释了我们在足月等效年龄 HI 后观察到的神经发生和少突形成的异常。
在这项研究中，我们决定在 HI 后等待 12 小时再开始西地那非治疗（而不是在 HI 后立即给药），以确保 HI 后损伤的第二阶段已经开始，并测试西地那非除了神经保护作用外的潜在神经修复作用。即使在 HI 损伤后 12 小时开始服用西地那非也具有如此有益的效果，这一事实与其他先前测试过的神经保护策略（如褪黑激素和氙气）形成鲜明对比，这些策略仅在新生儿 HI 大鼠模型的 HI 损伤之前、期间或之后给药时才有效47–49.例如，在 P7 Vannucci 模型中，在 HI 后 12 小时开始低温治疗对中度 HI 损伤的大鼠没有益处，甚至对严重 HI 损伤的大鼠有害50.只有促红细胞生成素在 HI 后延迟开始时显示出类似的有益效果51.在我们的研究中，即使西地那非治疗在 7 天后停止，其效果在 7 天治疗后仍持续存在，并且在 P30 时仍然很明显。我们通过口服途径而不是以前大多数动物实验中描述的腹膜内或皮下途径进行西地那非治疗22，因为口服西地那非是人类新生儿最常用的途径。根据我们在海马体中的组织学和免疫组织化学结果，10 mg/kg 剂量的西地那非似乎与高剂量 （50 mg/kg） 的西地那非一样有益。然而，只有 50 mg/kg 西地那非的剂量用于蛋白质印迹，因为西地那非对大脑皮层和视网膜具有明显的剂量依赖性有益作用，其中 50 mg/kg 是最有效的剂量8,9.仅在 P12 处测试细胞凋亡，而不是更早地测试，以确保治疗大鼠幼崽在处死前接受了 3 剂研究药物，从而确保测试西地那非的效果，即使 HI 后 48 小时在检查与初始 HI 损伤相关的细胞凋亡时可能较晚。
考虑到先前描述的雄性与雌性相比大脑修复有限，此处描述的实验仅在雄性大鼠幼崽中进行52，其想法是首先在不太倾向于修复过程的人群中测试研究药物的有益效果。将来进一步测试对西地那非治疗的潜在性别差异将很重要，因为 HI 和西地那非反应后的通路激活可能是性别依赖性的53.此外，必须测试西地那非治疗与治疗性低温相结合，以便在资源丰富的环境中进一步转化;这些治疗可能具有协同作用，例如，对细胞凋亡54.还应计划未来的功能实验，例如新颖的物体识别测试，以确定我们的发现是否转化为记忆的改善;先前的研究表明，西地那非带来的结构改善转化为步态和视力的功能改善8,9.
总之，海马体是新生儿 HI 大鼠模型中的易受攻击靶标。西地那非是一种很有前途的新型治疗方法，用于治疗足月等效年龄 HI 后的此类脑损伤。西地那非可能同时具有神经保护和神经恢复作用。西地那非减少了细胞凋亡，并重新建立了海马体出生后神经元发育程序的正常进展;西地那非还促进了少突胶质细胞的成熟，并减少了海马体的慢性神经炎症。所有这些影响导致 HI 后海马结构的保留。PI3K/Akt/mTOR 通路可能参与西地那非的这些神经保护和神经修复作用。
方法
动物和实验设计
我们的实验符合加拿大动物护理委员会关于实验动物护理和使用指南和动物研究法在研究中使用动物的标准操作程序和指南。它们得到了蒙特利尔儿童医院麦吉尔大学健康中心的当地动物护理委员会的批准。该研究是根据 ARRIVE 指南报告的。成年雌性 Long-Evans 大鼠及其仅雄性窝 （Charles Rivers Laboratories） 被接收在动物设施中，在标准环境中饲养，并允许随意进食和水。
新生儿 HI 的诱导
为了模拟在足月等效年龄的人类窒息新生儿中观察到的脑损伤，我们使用了足月等效年龄新生儿 HI 的成熟 Vannucci 大鼠模型55–57.该模型结合了缺血（左颈总动脉结扎）和 10 日龄 （P10） 雄性 Long-Evans 大鼠幼崽缺氧（8% 氧气）2 小时暴露。将全程大鼠视为 HI 组。假手术大鼠幼崽 （与 HI 组相同，但无结扎和缺氧） 作为对照组。当前研究的样本量是一个方便的样本量，但受审查它的机构伦理委员会施加的限制，并基于 3 R（替换、减少和细化）的原则。假大鼠和 HI 大鼠幼崽均维持正常的核心体温 （36 °C），同时在整个过程中（手术±缺氧）通过使用保暖毯（辛辛那提低于零度，辛辛那提，美国）将它们与母亲分开。
西地那非的制备和给药
西地那非（伟哥，100 毫克片剂;Pfizer） 的制备方式类似于用于人类新生儿治疗持续性肺动脉高压时®8,9.每天称重 HI 和假手术大鼠幼崽，并通过口服灌胃每天两次随机分配到西地那非或载体中，从 HI 后 12 小时开始，从 P11 到 P17 连续 7 天。对于组织学和免疫组织化学 （每组 n = 8-10 只大鼠幼崽），对 HI 大鼠幼崽使用三种不同剂量的西地那非 — 低剂量 （2 mg/kg）、中剂量 （10 mg/kg） 和高剂量 （50 mg/kg） — 这在一定程度上对应于人类新生儿的等效推荐量，并解释了人和大鼠代谢之间的差异58.对于蛋白质印迹法（每组 n = 6-10 只大鼠幼崽），仅使用高剂量 （50 mg/kg） 的西地那非，因为已发现它对大脑皮层和视网膜具有最有益的影响8,9.
海马大小
P30 时，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠 （100 mg/kg） 安乐死，然后经心灌注。提取大脑，后固定并连续切片。在海马区域收集切片。使用标准方案对苏木精和伊红进行染色后，用 5 ×物镜的光学显微镜检查切片。对于每个切片，使用连接到显微镜的数码相机拍摄重叠的显微照片。为了获得整个冠状切片的照片，使用全景图像拼接软件对照片进行拼接。同侧和对侧海马体的表面由一名研究者在两个切片上盲法测量，该研究者对治疗组细分不知情。对测量值进行平均以代表每只动物。为了消除个体体重的任何潜在影响，计算了同侧和对侧海马之间的比率，并用于组间比较。
神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞计数
在 P30 进行免疫组化。用一抗染色，通过用抗神经元核标记（小鼠抗 NeuN，MAB377;美国马萨诸塞州伯灵顿的 Millipore;稀释 1：500，室温孵育时间 1 小时），对于未成熟的少突胶质细胞，用少突胶质细胞转录因子 （Olig2） 标记（兔抗 Olig2，ab109186;Abcam，英国剑桥;稀释 1：500，在 4 °C 下孵育过夜），通过用抗腺瘤性息肉病大肠杆菌克隆 （CC1） 标记（小鼠抗 CC1，ab16794;Abcam，英国剑桥;稀释 1：1000，在 4 °C 下孵育过夜），通过用神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 标记星形胶质细胞（小鼠抗 GFAP，SMI-22R;Covance，美国新泽西州普林斯顿;稀释度为1：1000，在4°C下孵育过夜），并通过用电离钙结合接头分子1（Iba-1）标记小胶质细胞（兔抗Iba1,019-19741;Wako Pure Chemical Industries，日本大阪;稀释度 1：600，在 4 °C 下孵育过夜）。然后，将切片与其各自的二抗一起孵育。使用具有 20 ×物镜的光学显微镜观察染色的脑切片，并在海马的三个区域拍摄照片：即齿状回、山茱萸 （CA） 1 和同侧海马的 CA3 区域。计算每只动物同侧海马体这三个区域的神经元 （NeuN） 、少突胶质细胞 （CC1、Olig2）、星形胶质细胞 （GFAP） 和小胶质细胞 （Iba1） 的数量一名研究人员拍摄了各自的视野照片，另一名对治疗组细分不知情的研究人员评估了细胞计数。
早期/晚期神经元发育、细胞凋亡、轴突再生和 mTOR 通路的标志物
使用 western blot 在三个不同的时间点（P12、P17 和 P30）研究早期/晚期神经元发育、细胞凋亡、轴突再生和 mTOR 通路的标志物。解剖大脑，提取同侧海马组织并在液氮中快速冷冻并储存在 - 80 °C 下。 样品通过超声裂解。将裂解物离心，并通过 BCA 蛋白检测试剂盒 （23225） 测定其蛋白浓度。用 Laemmli 缓冲液 （S3401） 和蒸馏水稀释蛋白质样品，每个样品获得 15 μg 蛋白质。通过凝胶电泳分离蛋白质，然后将凝胶转印到聚偏二氟乙烯膜 （10600023） 上。蛋白质印迹与一抗一起孵育。更具体地说，我们跟踪了神经发育标志物在分化和成熟过程中的蛋白质表达谱。对于早期神经元标志物，我们测量了性别决定区 Y-box 2 （Sox2） 的表达（兔抗 Sox2，ab97959;Abcam，英国剑桥;稀释度 1：1000）、巢蛋白（小鼠抗巢蛋白，MAB353;美国马萨诸塞州伯灵顿的 Millipore;稀释度 1：1000）和双皮质素 （DCX）（兔抗 DCX，ab18723;Abcam，英国剑桥;稀释度 1：1000）。对于晚期神经元标志物，我们使用钙调蛋白（小鼠抗钙调蛋白，6B3pur;瑞士弗里堡 Swant， Marly;稀释度 1：1000）作为年轻有丝分裂后神经元群的标志物，钙结合蛋白（兔抗钙结合蛋白，CB 38;瑞士弗里堡 Swant， Marly;稀释度 1：500）作为成熟颗粒细胞的标志物59和 NeuN（小鼠抗 NeuN，MAB377;美国马萨诸塞州伯灵顿的 Millipore;稀释度 1：500）作为成熟神经元的标志物60.为了研究细胞凋亡，我们量化了 89 kDa 裂解的多聚 ADP 核糖聚合酶 （PARP） 的水平（兔抗 PARP，9542;Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹佛斯;稀释度 1：1000），这与凋亡细胞死亡有关。为了确定神经元变化是否转化为轴突水平，我们还测量了抗生长相关蛋白 43 （GAP-43） 的水平（绵羊抗 GAP-43，NBP1-41123;Novus Biologicals，美国科罗拉多州 Centennial;稀释度 1：1000），一种在神经元发育过程中在神经元生长锥中高水平表达的蛋白质，在轴突再生过程中也高水平表达。为了评估 Pl3k/AKT/mTOR 通路的活性，我们量化了磷酸化蛋白激酶 B （AKT） 的水平 （兔抗磷酸化 Akt Ser473 D9E，4060;Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹佛斯;稀释度 1：1000）;磷酸化 mTOR 丝氨酸 2448 水平（兔抗 p-mTOR Ser2448、2971;Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹佛斯;稀释度 1：1000），反映了雷帕霉素复合物 1 （mTORC1） 活性的哺乳动物靶标;磷酸化 mTOR Ser2481 水平（兔抗 p-mTOR Ser2481,2974;Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹佛斯;稀释度 1：1000），反映了雷帕霉素复合物 2 （mTORC2） 活性的哺乳动物靶标;和泛 mTOR 抗体水平 （兔抗 mTOR，2972;Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹佛斯;稀释度 1：1000）。初级孵育后，我们孵育膜各自的二抗。我们使用 Image Lab 软件分析了蛋白质印迹，并量化了它们的条带吸光度。我们使用肌动蛋白和总蛋白水平 （磷酸化蛋白） 表达作为标准化的管家蛋白。®
数据分析
为了进行分析，我们将 HI 大鼠幼崴细分为随机分配的治疗组：载体 （0 mg/kg） 或西地那非 （2、10 和 50 mg/kg 用于组织学和免疫组织化学，50 mg/kg 用于蛋白质印迹）。我们使用 Kruskal-Wallis 非参数检验评估了不同治疗组之间结局的统计差异;进行成对比较，将不同组的 HI 大鼠与用载体处理的假大鼠进行比较，并将西地那非处理的大鼠与用载体处理的 HI 大鼠进行比较。对于多重比较，我们应用 Dunn 事后比较检验来根据需要调整 α 水平。我们认为 p 值< 0.05 具有统计学意义。我们使用 GraphPad Prism （GraphPad Software Inc， San Diego， CA， USA） 进行了所有统计分析。®
作者贡献
A.Y.、B.H. 和 M.Z.S. 进行了所有实验，分析结果并对其进行解释，起草了初始手稿，并批准了提交的最终手稿。N.T. 帮助进行了一些实验，批判性地审查了手稿，并批准了提交的最终手稿。Z.K. 帮助完成了所有动物实验和部分实验，批判性地审查了手稿，并批准了提交的最终手稿。P.W. 构思和设计了这项研究，监督 A.Y.、B.H.、M.Z.S. 和 N.T. 对结果的分析和解释，审查和修改手稿，并批准提交的最终手稿。
资金
Armin Yazdani 获得了 2015 年 IPN 返校学生奖、2016-2017 年魁北克健康研究基金会 （FRQS） 和明星基金会颁发的博士培训奖，以及 2017 年蒙特利尔犹太社区基金会 （JCF） 史蒂文·扎尔克曼纪念奖学金。Belal Howidi 获得了 2020 年 IPN 返校学生奖，以及 2020 年 RI-MUHC 学生和奖学金。Meng Zhu Shi 获得了 Barkev 博士和 Alice Andonian 夫人儿科研究助学金和 Clarke K. McLeod 博士纪念奖学金。Pia Wintermark 获得了 FRQS 临床研究学者职业奖高级和加拿大卫生研究院 （CIHR） 项目资助的研究资助。
脚注
出版商注
施普林格·自然 （Springer Nature） 对已发布的地图和机构隶属关系中的管辖权主张保持中立。
这些作者的贡献相同：Armin Yazdani、Belal Howidi 和 Meng Zhu Shi。