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2022년 식중독 원인조사 시험법
2022 年食物中毒原因调查测试方法

III. 유전자 증폭법 III. 基因扩增法

i . 노로바이러스(Norovirus)
i . 诺如病毒(Norovirus)

바이러스의 특성 病毒的特性
  • Caliciviridae 속에 속하는 RNA 바이러스로 27-32nm의 크기
    属于 Caliciviridae 家族的 RNA 病毒，大小为 27-32nm
  • 낮은 감염량(10 100 particles)으로 비말 혹은 분변-경구 경로로 감염
    低感染量（10 100 颗粒）通过飞沫或粪便-口服途径感染
  • 소장 미세융모 손상으로 인한 흡수장애로 증상 발현되고 환경에 대한 저항성이 강함
    由于毛细血管损伤导致吸收障碍，症状表现并且对环境具有强烈抵抗力
증장상
  • 묽은 설사변, 설사 1 2일 후 구토, 2 3일간 지속되는 발열, 탈수, 권태감, 오심, 복통, 호흡기 증상 등
    腹泻后，1 到 2 天后出现呕吐，持续 2 到 3 天的发热，脱水，倦怠感，恶心，腹痛，呼吸道症状等
  • 잠복기: 시간 潜伏时间: 小时
  • 어린이, 노인 및 면역력이 약한 사람에게 탈수증상이 일어날 수 있음
    儿童、老年人和免疫力较弱的人可能出现脱水症状

1. Duplex Real-time RT-PCR
1. 双工实时 RT-PCR

※ PCR에 사용되는 real-time RT-PCR mix는 본 시험법에서 제시한 제품(Agpath ID one-step RT-PCR reagent) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다(재현성 및 검출효율 등을 고려하여 동등 이상의 제품 사용 가능).
※ 本试验方法中可使用的 real-time RT-PCR 混合物是本试验方法中提供的产品（Agpath ID one-step RT-PCR 试剂）或同等以上产品（考虑到再现性和检测效率等，可以使用同等以上产品）。
※ 증폭 과정의 오류점검을 위해 노로바이러스 real-time RT-PCR 양성대조군과 유전자 추출 과정을 거친 음성대조군을 시료와 함께 증폭 반응 한다.
为了检查扩增过程中的错误点，将经过诺罗病毒实时 RT-PCR 阳性对照组和经过基因提取过程的阴性对照组与样本一起进行扩增反应。
※ Real-time PCR well에 혼합액 분주 시 거품이 발생하지 않도록 주의한다.
※ 注意在实时 PCR 孔中分配混合液时，避免产生气泡。
※ 증류수는 역삼투압 정제 등에 의해 까지 정제한 초순수로 DNA, DNase 등의 오염이 없는 것을 사용한다. 또한, 추출된 RNA 원액을 희석할 때는 DEPC 처리 증류수를 이용한다.
※ 蒸馏水经过逆渗透和高压净化等处理，纯度高达 ，是不含 DNA、DNase 等污染物的超纯水。此外，在稀释提取的 RNA 原液时，使用经 DEPC 处理的蒸馏水。

1) Primer/probe 염기서열 1) 引物/探针碱基序列

유전형 Primer 및 probe 底漆和探针 염기서열(5)  碱基序列(5) 위 치
COG1F (F)CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA 5291
RING1(a)-TP (R)CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
(R)CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C (R)CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C		 5375
BPO-13N (F)AIC CIA TGT TYA GIT GGA TGA G 5007
(F)AGT CAA TGT TTA GGT GGA TGA G
(F)AGT CAA TGT TTA GGT GGA TGA G (F)AGT CAA TGT TTA GGT GGA TGA G		 5007
BPO-14 (R)TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 5101

2) Real-time RT-PCR 반응액 조성
2) 实时 RT-PCR 反应物组成

구성성분 组成成分 용량(  容量( 비고 Genogroup 基因组
primers  个引物 GII primers GII 引物
RT-PCR buffer  RT-PCR 缓冲液 12
Enhancer 增强剂 1.5
Enzyme mix  酶混合物 0.5
(10 pmol)  （10 pmol） 3 각  每个 COG1F BPO-13
Primer(R) (10 pmol) 引物(R) (10 pmol) 2 각  每个 COG1R BPO-14
Probe (10 pmol) 探针（10 pmol） 1 각 0.5 每个 0.5 RING1(a)-TP BPO-18
RNA 5
Total 总共 25
  • 유전자 추출과정에서 4개로 추출된 시료의 RNA는 real-time RT-PCR 증폭액이 분주되어 있는 plate의 well에 를 첨가하되 각 당 3 개의 well에 첨가한다.
    在基因提取过程中，从 4 个样品中提取的 RNA 被加入到已经装有 real-time RT-PCR 扩增液的板的孔中，每个 个孔中加入 ，每个孔中加入 3 个。
※ 절임식품의 경우, RNA 원액을 포함하여 RNA 희석액(1:2, 1:5, 1:10)도 real-time RT-PCR을 수행한다.
※ 在腌制食品的情况下，包括 RNA 原液在内的 RNA 稀释液（1:2、1:5、1:10）也进行实时 RT-PCR 检测。

2022년 식중독 원인조사 시험법
2022 年食物中毒原因调查测试方法

  1. Duplex Real-time RT-PCR 반응조건
    双工实时 RT-PCR 反应条件
구분 온도  温度 시간 Cycle 수 周期数
cDNA synthesis cDNA 合成 45 30 분 30 分钟 1
Denaturation 变性 95 10 분 10 分 1
Cycling Stage 骑行阶段 95 15 초 15 秒 45

4) Duplex Real-time RT-PCR 결과 해석
4) 双工实时 RT-PCR 结果解读

(1) 반응이 종료 후 FAM-TAMRA detector를 적용한 경우의 증폭 곡선이 확인되는 경우 노로바이러스 GI, VIC-TAMRA detector를 적용한 경우의 증폭 곡선이 확인된 경우는 노로 바이러스 로 검출을 확인한다.
(1) 反应结束后应用 FAM-TAMRA 探测器时出现扩增曲线的情况确认为诺如病毒 GI，应用 VIC-TAMRA 探测器时出现扩增曲线的情况确认为诺如病毒 检测。
(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 증폭 곡선이 확인되거나 또는 양성대조군에서 확인 되지 않을 경우 등은 유전자 추출과정부터 재시험을 실시해야한다.
如果在阴性对照组中发现扩增曲线，或者在阳性对照组中未发现扩增曲线等情况，应从基因提取过程开始重新进行实验。
(3) Duplex Real-time RT-PCR에서 노로바이러스로 확인된 RNA 시료는 Conventional RT-PCR을 수행하여 유전자형을 결정한다.
(3) 通过双工实时 RT-PCR 确认为诺如病毒的 RNA 样本，将进行常规 RT-PCR 以确定基因型。

2. Conventional RT-PCR 2. 传统 RT-PCR

※ PCR로 노로바이러스의 유전자형(GI과 을 각각 확인하기 위하여 유전자형에 따라 primer를 바꿔 semi-nested PCR을 한다. RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 과정에서는 노로바이러스 유전자와 로타바이러스 유전자를 조합하여 합성한 RNA(GI, GII)를 양성대조군으로 사용한다.
※ 为了确认诺如病毒的基因型（GI 和 ），需要根据基因型更换引物进行半巢式 PCR。在 RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）过程中，将诺如病毒基因和轮状病毒基因组合合成的 RNA（GI，GII）用作 阳性对照组。
※ OPC(Oligonucleotide Purification Cartridge)로 정제된 primer를 사용한다.
使用经过寡核苷酸纯化柱（OPC）纯化的引物。
※ RT-PCR에 사용되는 One-step RT-PCR mix는 본 시험법에서 제시한 제품(Superscript IV one-step RT-PCR system) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.
※ 可以使用本试验方法中提供的产品（Superscript IV one-step RT-PCR system）或同等以上的产品来进行 One-step RT-PCR 混合物的 RT-PCR。
※ 2차 PCR (semi-nested PCR)에 사용되는 Taq DNA polymerase, buffer 포함), dNTPs (each dNTP )의 필요한 시약을 갖추어 PCR을 실시한다 (이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 DNA polymerase, buffer, dNTPs도 사용할 수 있다). ※ 증류수는 역삼투압 정제 등에 의해 까지 정제한 초순수로 DNA, DNase 등의 오염이 없는 것을 사용한다. 또한, 추출된 RNA 원액을 희석할 때는 DEPC 처리 증류수를 이용한다.
※ 用于第二次 PCR（半嵌套 PCR）的 Taq DNA 聚合酶， 缓冲液 （含）， dNTPs（每个 dNTP ）的必要试剂进行 PCR 反应（也可以使用具有相同效果的 DNA 聚合酶、缓冲液、dNTPs）。※ 纯化水经逆渗透净化等处理可纯化至 ，用于无 DNA、DNase 等污染的超纯度。此外，在稀释提取的 RNA 原液时，使用 DEPC 处理的纯化水。

2.1 One step RT-PCR
2.1 一步 RT-PCR

  1. Primer 염기서열 引物序列
유전형 Primer 底漆 염기서열(5-  碱基序列(5-
GI GI-F1M (F)CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT
(F)CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT （F）CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT
GI-R1M (R)CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG
GII GII-F1M (F)GGG AGG GCG ATC GCA ATC T
(F)GGG AGG GCG ATC GCA ATC T （F）GGG AGG GCG ATC GCA ATC T
GII-R1M (R)CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT
  1. One-step RT-PCR 반응액 조제
    一步法 RT-PCR 反应液配制
구성성분 组成成分 용량  容量 Genogroup 基因组
Master mix(2) 主混合物(2) GII primers GII 引物
Reverse transcriptase(50 unit/
反转录酶（50 单位/ 		9.5
Primer(F)  底漆(F) 0.5
Primer(R)  底漆(R) 2 GI-F1M GII-F1M
D.W. 2 GI-R1M GII-R1M
RNA 6
Total 总共 5

2022년 식중독 원인조사 시험법
2022 年食物中毒原因调查测试方法

  1. One-step RT-PCR 반응조건 一步法 RT-PCR 反应条件
구분 온도  温度 시간 Cycle 수 周期数
cDNA synthesis cDNA 合成 45 30 분 30 分钟 1
Initial denaturation 初始变性 94 5 분 1
Cycling Stage 骑行阶段 94 30 초 30 秒
55 30 초 30 秒 35
72 1 분 30 초
1 分 30 秒

2.2 Semi-nested PCR 2.2 半嵌套 PCR

  1. Primer 염기서열 引物序列
유전형 Primer 底漆 염기서열(5' ) 碱基序列(5' ) 산들크기(bp) 山地克氏(bp)
GI GI-F2-U (F)AAT ACG ACT CAC TAT AGA TGA TGA TGG CGT CTA
(F)AAT ACG ACT CAC TAT AGA TGA TGA TGG CGT CTA (F)AAT ACG ACT CAC TAT AGA TGA TGA TGG CGT CTA
GI-R1M (R)CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG 330
GII GII-F3M (F)TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART
(F)TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART (F)TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART
GII-R1M-U
(R)GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GCC RCC IGC ATR
ICC RTT RTA CAT
332
  1. Semi-nested PCR 반응액 조제
    半嵌套 PCR 反应液配制
구성성분 组成成分 용량(  容量( Genogroup 基因组
GI primers GI 引物 GII primers GII 引物
dNTPs(10 mM) dNTPs（10 mM） 4
Buffer(with )
缓冲区（带有 ）		 5
Taq DNA polymerase(5 unit/uL)
Taq DNA 聚合酶（5 单位/μL）		 1
pmol   皮摩尔 2.5 GI-F2-U GII-F3M
(20 pmol)  （20 皮摩尔） 2.5 GI-R1M GII-R1M-U
D.W. 33
1st PCR Product 第一个 PCR 产物 2
Total 总共 50
  1. Semi-nested PCR 반응조건 半嵌套 PCR 反应条件
구분 온도  温度 시간 Cycle 수 周期数
Initial denaturation 初始变性 94 5 분 1
Cycling Stage 骑行阶段 94 30 초 30 秒
55 30 초 30 秒 25
72 1 분 30 초
1 分 30 秒
Storage 存储 72 7 분 1

4) 산물 확인
4) 产品确认

(1) 반응종료 후 증폭 반응액 를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭 산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (marker DNA) 를 넣는다. 1.5% 아가로즈 젤 (agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 ) 또는 동등 이상의 제품으로 30 분간 염색한 후 증류수로 10 분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.
(1) 反应结束后，将 扩增反应液 与电泳填充液(gel loading buffer) 混合，然后将样品小心地放入凝胶(gel)的每个槽中，将适量的标记 DNA (marker DNA) 放入剩余的一个槽中，以便识别 PCR 扩增产物的大小。在 1.5%琼脂糖凝胶 (agarose gel) 上以 100V 进行电泳后，用溴化乙啶(EtBr) 染色液(10 ) 或等效产品染色 30 分钟，然后用脱色水脱色 10 分钟，用紫外线透射仪(UV transilluminator) 检查并观察扩增的 DNA 条带。
(2) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 의 밴드가 있을 경우 Gl형 노로바이러스로, 의 밴드가 있을 경우 형 노로바이러스로 일차 확인하되, 양성대조군 형은 형은 로 확인되어야 한다. 만일 음성대조군(negative control)이나 검체에서 양성대조군(positive control)과 같은 크기의 밴드가 확인되거나 양성대조군에서 밴드가 확인되지 않을 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 참고).
(2) 在琼脂糖凝胶上，如果样品中有 条带，则初步确认为 GⅠ型诺如病毒，如果有 条带，则初步确认为 型诺如病毒，阳性对照组为 型，应确认为 型，如果在阴性对照组或样本中发现与阳性对照组相同大小的带或阳性对照组中未发现带等情况，则应进行重新测试（见表）。
추출 RNA(시료) 提取 RNA（样本） 양성대조군 阳性对照组 음성대조군 声音对照组 1차 판정 1 次判定
1 + + - PCR 검출 PCR 检测
+
2 + + - 검출  检测
-
3 + + + 재 실험 重复实验
+
4 + - - 재 실험 重复实验
-
5 - + - PCR 불검출 PCR 检测阴性
-

2022년 식중독 원인조사 시험법
2022 年食物中毒原因调查测试方法

(3) 노로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 해당 부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 판정한다.
(3) 如果诺如病毒初步确认，为了最终确认，在琼脂凝胶上切取相应部位，提取 PCR 产物后，通过 DNA 测序分析来判断。

2.3 염기서열 분석(DNA sequencing)
2.3 DNA 测序

  1. Primer 염기서열 引物序列
염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 2.2, 4), (3)에서 정제된 DNA를 주형으로 바 이러스 유전형 및 진행 방향에 따라 semi-nested primer를 사용한다.
为了 DNA 测序，使用从(2.2, 4), (3)中纯化的 DNA 作为模板，根据病毒基因型和扩增方向使用半嵌套引物。
  1. 염기서열 분석(DNA Sequencing) 반응액 조제
    DNA 测序反应液配制
구성성분 组成成分 용량(  容量( Genogroup 基因组
Gl primers Gl 底漆 Gll primers Gll 引物
dye-terminator 染料终止剂 2
Primer(F) (1 pmol) 引物(F) (1 pmol) 2 GII-F3M
Primer(R) (1 pmol) 引物(R) (1 pmol) 2 GI-R1M
정제 DNA 精制 DNA 2
D.W. 2
Total 总共 10
  1. 염기서열 분석(DNA Sequencing) 반응조건
    DNA 测序的反应条件
구분 온도  温度 시간 Cycle 수 周期数
Initial denaturation 初始变性 96 1 분 1
Cycling Stage 骑行阶段 96 10 초 10 秒
50 5 초
60 4 분 25
  1. 결과 확인 结果确认
  • PCR 산물은 직접 염기서열 분석(DNA sequencing)하되, 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA Sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA Sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 노로바이러스 유전자 데이터베이스 (GI, GII Reference sequence 및 NCBI blast 교차비교)와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.
    PCR 产物直接进行碱基序列分析(DNA 测序)，但如果混合了两种或两种以上的基因，则进行克隆碱基序列分析(Cloning DNA Sequencing)。通过碱基序列分析(DNA Sequencing)确定的碱基序列将与诺如病毒基因数据库（GI、GII 参考序列和 NCBI blast 交叉比对）进行比对，确认为诺如病毒后即可最终确认检测到的结果。
  1. ※ + : 노로바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음
    ※ +：检测到诺罗病毒 PCR 带，-：未检测到带
summarize 总结