摘要
NLRP3 炎症体是产生活化型白细胞介素（IL）-1β的关键先天免疫途径，与肿瘤发展和免疫有关。然而，调控炎症微环境、肿瘤发生和肿瘤免疫的机制尚不清楚。本研究显示，NLRP3 炎症体在人类 HNSCC 组织中过度表达，HNSCC 患者外周血中 IL-1β浓度增加。此外，在 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠的肿瘤组织中检测到 NLRP3 炎症体水平升高，并在小鼠的外周血清、脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织中检测到 IL-1β水平升高。通过 MCC950 阻断 NLRP3 炎症体激活显著减少了 HNSCC 小鼠模型中的 IL-1β产生，并减少了髓系衍生抑制细胞（MDSCs）、调节性 T 细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的数量。此外，抑制 NLRP3 炎症体激活增加了 HNSCC 小鼠中的 CD4 + 和 CD8 + T 细胞数量。值得注意的是，耗竭的 PD-1 + 和 Tim3 + T 细胞的数量显著减少。 人 HNSCC 组织微阵列显示，NLRP3 炎症小体的表达与 CD8 和 CD4 的表达、Treg 标记物 Foxp3、MDSC 标记物 CD11b 和 CD33 以及 TAM 标记物 CD68 和 CD163、PD-1 和 Tim3 相关。总体而言，我们的结果表明，NLRP3 炎症小体/IL-1β途径促进 HNSCC 的肿瘤发生，并且该途径的失活延迟了肿瘤生长，伴随着免疫抑制细胞积累的减少和效应 T 细胞数量的增加。因此，通过 NLRP3 炎症小体/IL-1β途径抑制肿瘤微环境可能为 HNSCC 治疗提供一种新的方法。
电子补充材料
关键词：NLRP3 炎症小体，IL-1β，免疫抑制细胞，PD-1，Tim3，HNSCC
简介
而炎症对于宿主先天免疫系统对抗病原体至关重要，累积的研究表明炎症在肿瘤的启动和发展中扮演着重要角色[1, 2]。然而，先天免疫衍生的炎症微环境在肿瘤进展中的机制仍然不清楚。炎症小体是产生活性 IL-1β的关键先天免疫途径，IL-1β是一种关键的炎症细胞因子[3]，它作为一把双刃剑，既参与宿主防御，也与自身免疫疾病和癌症有关[4]。作为研究最广泛的炎症小体，NLRP3（nod-like 受体蛋白 3）炎症小体由 NLRP3 支架、适应性凋亡相关蛋白含 caspase 募集域（ASC）和负责将前 IL-1β和前 IL-18 蛋白切割成活性形式的 caspase-1 组成。异常分泌的 IL-1β与多种自身免疫疾病和肿瘤有关[5]，并与某些癌症患者的预后较差相关[6, 7]。 目前，关于 NLRP3 炎性体和 IL-1β途径在炎症微环境和肿瘤免疫中的作用知之甚少。
每年中国大约有 48,100 例新发病例，2015 年的死亡率高达 50% [8]，头颈鳞状细胞癌（HNSCC）在全世界最常见的癌症中排名第六 [9]。尽管我们对癌症的理解有所提高，但 HNSCC 患者的 5 年生存率（50%）在过去三十年中相对未变 [10]。广泛的研究表明，HNSCC 是一种免疫抑制性恶性肿瘤 [11]，其特征是抗原呈递能力受损 [12]，自然杀伤细胞功能受损 [13]，淋巴细胞数量较少和存在免疫抑制细胞 [14, 15]。最近的研究表明，炎症小体和 IL-1β途径可以调节髓系细胞的招募并促进乳腺癌的生长和转移 [16]。然而，炎症如何影响 HNSCC 的肿瘤免疫机制尚不清楚。
免疫抑制细胞的积累，包括髓系衍生抑制细胞（MDSCs）、调节性 T 细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞可以损害 T 细胞反应并在肿瘤患者中导致免疫抑制状态，这意味着肿瘤的发生可能更加容易[17]。此外，慢性炎症可以诱导癌症患者的免疫抑制，过程中，MDSCs、Tregs 和 TAMs 被诱导为抑制细胞，但免疫细胞如 T 细胞和 NK 细胞被抑制[18]。小鼠中 NLRP3 的敲除可以有效地减少 MDSCs[19]和 TAMs[16]的数量。然而，炎症如何影响肿瘤免疫的机制尚不清楚。越来越多的证据表明，Tregs、MDSCs 和 TAMs 与 HNSCC 的免疫抑制状态有关[20, 21]。免疫检查点阻断疗法已经证明，体内免疫反应可以导致人类肿瘤的退缩[22]。PD-1 和 T 细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（Tim3）的失调也可以导致 HNSCC 的免疫抵抗[21, 23]。 炎症小体介导的 IL-1β可以诱导 TAMs 和 MDSCs 的招募，促进乳腺癌的发展 [16]。尽管 NLRP3 炎症小体在炎症微环境、免疫应答对抗感染和肿瘤发展中起着重要作用，但 NLRP3 炎症小体/IL-1β信号在炎症微环境和肿瘤免疫中的作用在头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中仍然认识不足。在这项研究中，我们研究了小鼠和人类 HNSCC 中 NLRP3 炎症小体/IL-1β的表达，并分析了 HNSCC 患者中 NLRP3 炎症小体、免疫抑制细胞标记和免疫检查点蛋白 PD-1 和 Tim3 之间的关系。此外，我们探讨了在 NLRP3 失活后 HNSCC 在小鼠中的免疫变化。
材料和方法
试剂
NLRP3 抑制剂 MCC950（PZ0280）从 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买，人和小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒从大为生物科技（中国北京）购买。免疫组织化学、免疫荧光和 Western blot 所需抗体：caspase-1、IL-1β、Foxp3、CD8、CD4、PD-1、Tim3 和 SIRPα来自 Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州波士顿）；IL-18、CD11b 和 CD47 来自 Abcam（英国剑桥）；CD8、CD68 和 CD33 来自 Zymed（美国加州圣地亚哥）；ASC 和 CXCL1 来自 GeneTex Inc.（美国加州欧文）；CD4 和 Ly6G 来自 Service Bio（中国武汉）；CD11b 和 CCL2 来自 Novus Biologicals（美国科罗拉多州利特尔顿）；CD163 来自 CWBiotech（中国北京）；NLRP3 来自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；CK14 来自 PROGEN（德国海德堡）。所有流式细胞术用抗体均来自 eBioscience（美国加州圣地亚哥）：PE 偶联的 LY6G、Foxp3、PD-1、Tim3 和 F4/80，PE-Cy7 偶联的 LY6C，FITC 偶联的 CD4 和 CD11b，PE-Cy5 偶联的 CD8，以及 APC 偶联的 CD25。
老鼠
实验中使用的老鼠是可诱导和组织特异性的 HNSCC 小鼠模型[24]；4-8 周大的 Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠（K14-Cre tam ；Tgfbr1 flox/flox ；Pten flox/flox ）连续五天接受他莫昔芬灌胃，以条件性删除小鼠头颈部上皮中的 Tgfbr1 和 Pten，这可能导致 PI3K/Akt 途径的激活和 TGF-β的分泌增加；最终，这些老鼠的头颈部形成了完全穿透性和免疫功能正常的鳞状细胞癌[24]。来自同一窝的 Tgfbr1 flox/flox /Pten flox/flox 小鼠用作对照。所有小鼠均保持在 FVBN/CD1/129/C57 混合背景中。动物研究得到了武汉大学动物福利和使用委员会的批准和监督。
MCC950 体内治疗
Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠（n = 18）在诱导他莫昔芬后，随机分为三组。MCC950 每天通过腹腔注射（10 mg/kg 或 15 mg/kg）前 3 天，接下来的 20 天每两天一次。治疗开始在第 14 天，通过灌胃和 PBS 通过腹腔注射到小鼠作为阴性对照。肿瘤体积每天通过微米卡尺计算。在灌胃后第 49 天，小鼠被杀死，脾脏、血液、引流淋巴结和肿瘤被分离并立即保存。
人类外周血
武汉大学口腔医院收集了健康捐赠者和 HNSCC 捐赠者的血液。研究血液成分在初次捐赠和每次后续捐赠前对每位捐赠者的血液进行了标准血液传播病原体的检测。仅使用了 HIV、HTLV、HCV 和 HBV 均为阴性的血液样本。从所有参与者处获得了书面知情同意。
组织微阵列
本研究使用的 HNSCC 组织微阵列（TMA）包含 64 例原发性 HNSCC，38 例正常口腔黏膜和 12 例口腔上皮异型增生（Dys）；还有一些其他类别未包含在此次实验中。这些标本从 2008 年 1 月至 2014 年 8 月在武汉大学口腔医院口腔颌面外科收集。根据国际癌症联盟（UICC 2002）指南，HNSCC 的临床分期，根据世界卫生组织的方案确定组织学分级。所有研究在试验开始时均获得患者的知情同意，并由武汉大学口腔医院医学伦理委员会批准。
ELISA 检测试剂盒
新鲜的人类或小鼠血液和组织匀浆（每毫升 PBS 1 克组织）在 3000 转/分钟下离心 20 分钟，以获取上清液。根据生产商的说明，通过 Dakewe BioTech（北京，中国）的 IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒，确定人类和小鼠样本上清液中的 IL-1β浓度。
流式细胞术
流式细胞术中，将脾、血液、淋巴结和肿瘤的单细胞悬液在 PBS 缓冲液（含 2% FBS）中重新悬浮，并在 4°C 下阻断非特异性 Fc，持续 10 分钟，然后细胞用上述荧光标记的单克隆抗体进行染色。对于非细胞表面标记 Foxp3 的染色，在抗体孵育前根据制造商的说明穿透细胞膜（eBioscience，美国圣地亚哥）。样本在 NovoCyte 流式细胞仪（ACEA NovoCyte™，美国圣地亚哥）上获取，数据由其相应的软件 NovoExpress 进行分析。实验中使用同种型 IgG 抗体作为对照。
免疫组织化学
免疫组织化学中，将石蜡包埋组织的 4 微米切片在含有钠柠檬酸的介质中加热至沸腾，持续 5 分钟以揭示抗原。切片在 37°C 下用 3%过氧化氢处理 20 分钟，以抑制内源性过氧化酶活性。然后，使用 10%山羊正常血清（ZSGB-BIO，中国北京）在 37°C 下处理 20 分钟，以阻断非特异性结合，并在 4°C 下过夜用适当稀释的特异性主要抗体处理。处理 1 小时后，切片与相应的生物素化免疫球蛋白 G 抗体溶液和链霉亲和素-生物素-过氧化物酶试剂在室温下孵育，并用 DAB 试剂盒（Mxb Biotechnologies，中国福州）染色，然后用梅氏苏木素（Invitrogen，美国加州卡尔斯巴德）轻度复染。人类 HNSCC 组织微阵列的免疫组织化学按照相同方式执行。每种抗体均提供 PBS 阴性对照组和相应的阳性对照组。
免疫荧光
免疫荧光的所有步骤在添加荧光偶联的二抗之前，与免疫组织化学相同。切片在黑暗中于 37°C 下与相应的荧光抗体（DyLight 488 抗兔和抗鼠，DyLight 594 抗兔和抗鼠；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）孵育 1 小时，然后使用 DPAI 的抗荧光淬灭介质（Vector，美国加利福尼亚州伯灵格姆）进行固定。通过荧光显微镜（CLSM-310，德国蔡司荧光显微镜）或共焦激光扫描显微镜（FV300，日本东京奥林巴斯生命科学）进行观察。
Western blot
肿瘤组织在小鼠牺牲后采集，并使用预先添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 试剂（Pierce，罗克福德，伊利诺伊州，美国）进行裂解。然后，通过超声处理和离心产生蛋白质提取物。在加载缓冲液（Service Bio，武汉，中国）中变性后，从裂解物中提取的蛋白质在 8-12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Merck Millipore，比勒里卡，马萨诸塞州，美国）。膜在室温下用 5%脱脂奶粉处理 1 小时，然后在 4°C 下用适当稀释的特异性主要抗体孵育过夜。1 小时后，膜用 HRP 偶联的二级抗体在室温下孵育；用 ECL 试剂盒（Advansta Inc.，门洛帕克，加利福尼亚州，美国）检测印迹。
评分系统和层次聚类
所有切片均由 Aperio ScanScope CS 扫描仪（Aperio，美国圣地亚哥，CA）扫描，带有背景减除。每个样本的组织评分量化由 Aperio 量化系统（版本 9.1）[24]进行分析。对于层次聚类，每个生物标志器的组织评分转换为围绕零（-3-0-3）的缩放值，在 Microsoft Excel 中，然后使用平均链接基于皮尔逊相关系数的 Cluster 3.0 进行层次分析[25]。使用 Java TreeView 1.1.6 可视化结果[26]。最后，聚类数据和组织样本分别在水平和垂直轴上排列。具有密切关系的生物标志器位于彼此旁边。
统计分析
GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA）用于统计分析。对于两组之间的数据，采用未配对或配对 t 检验。对于多组之间的数据，使用单因素 ANOVA。在相关性分析中应用了双尾皮尔逊统计。数据表示为平均值±SEM，显著性确定为 p<0.05。
结果
NLRP3 炎症小体在人类 HNSCC 和 HNSCC 的小鼠模型中的表达被提升
为了确定头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中 NLRP3 炎症小体和 IL-1β的表达，我们对以下人类 HNSCC 组织样本进行了免疫组织化学染色：38 份正常口腔黏膜样本，12 例不典型增生（Dys）病例和 64 例人类 HNSCC 病例。我们发现，与不典型增生和黏膜样本相比，人类 HNSCC 中 NLRP3 炎症小体成分 NLRP3、ASC、caspase-1 和 IL-18 的表达增加（图 1a）。NLRP3 炎症小体作为 IL-1β的主要激活平台；根据在线 Oncomine 数据库的分析，我们发现彭、叶和 Ginos Head-Neck 数据集中的 IL-1B mRNA 水平高于正常黏膜（图 1b 和图 S1a）。这一结果也在 TCGA 数据库中得到验证（图 1c）。此外，我们的 ELISA 结果证实，与健康捐赠者（HD，n=10；HNSCC，n=10；图 1d）相比，HNSCC 患者的外周血中 IL-1β的浓度显著升高。此外，我们采用自发性原发性 HNSCC 小鼠模型进行了体内实验。 同样地，在 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠肿瘤组织（图 1e）中发现了 NLRP3、ASC、caspase-1 和 IL-18 的过度表达。根据 ELISA 结果，自发性 HNSCC 小鼠的外周血、脾脏、引流淋巴结（DLN）和肿瘤匀浆中的 IL-1β表达量比野生型小鼠高（图 1f）。
图 1。
NLRP3 炎症体在人类和小鼠 HNSCC 中均过表达。a 口腔黏膜（n = 38）、不典型增生（Dys，n = 12）和头颈鳞状细胞癌（HNSCC，n = 64）的免疫组织化学组织评分（NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18），单因素方差分析。b Peng Head-Neck 数据集中头颈癌与正常对照的 IL1B mRNA 表达水平（log2 中位数中心比值）（t 检验，p = 4.52E−10）。c TCGA 数据集中 44 个正常黏膜和 520 个 HNSCC 组织的 IL1B mRNA 表达水平分析（t 检验，p = 0.0073）。d 通过 ELISA 测量人类外周血中 IL-1β的浓度（10 个健康供体和 10 个 HNSCC，t 检验，p = 0.001）。e Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠（n = 6）中 NLRP3、caspase-1、ASC 和 IL-18 的定量组织评分显著高于野生型小鼠（n = 6），t 检验。f Tgfbr1/Pten 2cKO 肿瘤携带小鼠（n = 6）中 IL-1β在各种组织中的上调与野生型小鼠（n = 6）相比，t 检验。所有数据均以均值±SEM 表示
NLRP3 炎性小体活性的抑制在头颈鳞状细胞癌的鼠标模型中延迟了肿瘤的发生
为了评估 NLRP3 炎症小体和 IL-1β在肿瘤生长中的作用，我们利用了我们自发的原发性 HNSCC 小鼠模型，该模型表现出 NLRP3 炎症小体/IL-1β信号的持续激活。我们检查了特定小分子抑制剂 MCC950 对 NLRP3 炎症小体化学预防性抑制的有效性。在给药他莫昔芬后，每天评估肿瘤生长。结果表明，以 10 mg/kg 剂量的 MCC950 治疗显著延迟了肿瘤生长的进展，而以 15 mg/kg 剂量的 MCC950 治疗产生了更好的效果（*p < 0.05，**p < 0.01；图 2a）。ELISA 结果显示，MCC950（15 mg/kg）治疗后，外周血清、脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织中 IL-1β的水平显著降低（图 2b）。此外，Tgfbr1/Pten 2cKO 肿瘤携带小鼠处于免疫失调状态，小鼠表现出淋巴结肿大和脾肿大[21, 30, 31]的特征。然而，我们观察到在 MCC950 治疗后，淋巴结和脾脏的大小减小了（图。） 2c, d)，这可能表明肿瘤携带小鼠的免疫抑制状态可能已被部分缓解。
图 2。
MCC950 治疗减少了 IL-1β的产生，并在头颈鳞状细胞癌小鼠模型中延缓了肿瘤的发生。a 在 Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠中，通过口服他莫昔芬监测肿瘤体积。每组 6 只小鼠（*p < 0.05，**p < 0.01）。b 在接受 MCC950 治疗后，2cKO 携带肿瘤小鼠的血液、脾脏、副淋巴结和肿瘤中的 IL-1β水平下降，采用单因素方差分析进行测试。c 三组的脾脏和引流淋巴结的代表性照片显示，MCC950 可以减少脾脏和淋巴结的体积。d 脾脏指数显示显著差异（左图，单因素方差分析），淋巴结的大小被测量（右图，单因素方差分析）。所有数据均以平均值±SEM 表示
在头颈鳞状细胞癌的小鼠模型中，NLRP3 炎症小体的失活减少了调节性 T 细胞的数量
调节 T 细胞（Tregs）的存在是肿瘤携带者免疫抑制状态的一个原因，这些细胞可以通过特定的分子标记 CD4、CD25 和 Foxp3 进行区分[32]。此外，我们之前的数据显示，在 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠中，Tregs 的比例显著增加[21]。在本研究中，使用流式细胞术，我们发现 MCC950（10 和 15 mg/kg）处理组的 Tregs 数量减少（图 3a）。然而，在 15 mg/kg MCC950 处理组中，脾脏中 CD4 + Foxp3 + CD25 + 细胞的群体与 10 mg/kg MCC950 处理组和对照组相比显著减少（图 3b）。在血液样本中，CD4 + Foxp3 + CD25 + 细胞的数量在 10 和 15 mg/kg MCC950 处理组中均减少（图 3b）。然而，我们没有在 DLN 样本中观察到 MCC950 处理后 Tregs 比例的有意义变化（图 3b）。 此外，免疫化学结果显示，MCC950 治疗组（10 和 15mg/kg）小鼠肿瘤组织中的 Foxp3 阳性细胞数量明显少于对照组（图 3c, d）。这些结果表明，在 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠中，MCC950 治疗后肿瘤微环境中的 Tregs 亚群数量减少。
图 3。
抑制 NLRP3 炎性小体在头颈鳞状细胞癌小鼠模型中减少了常规 T 细胞的群体。a 流式细胞术显示 PBS-和 MCC950 处理的小鼠脾脏中 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs 群体的变化。b 三组 CD4 + 细胞中常规 T 细胞比例的量化和统计分析（数据表示为均值±SEM）。c 代表性的免疫组织化学染色图像显示三组 Tgfbr1/Pten2cKO 小鼠肿瘤中 Foxp3 阳性细胞密度的差异；刻度尺=50 μm；箭头指向阳性染色。d Foxp3 的免疫组织化学组织评分的量化（数据表示为均值±SEM）
NLRP3 inflammasome 的失活在小鼠 HNSCC 模型中减少了 MDSCs 和 TAMs 的数量
近期研究表明，MDSCs 和 M2 巨噬细胞在 HNSCC 中作为抗肿瘤免疫反应的负调节因子发挥作用 [20, 23]，这两种细胞类型在 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠中数量众多 [21]。MDSCs 可进一步分为 CD11b + LY6G − LY6C high 单核型和 CD11b + LY6G + LY6C low 粒细胞型 MDSCs；这两种亚群在癌症中具有不同的功能，几乎所有肿瘤类型都显示了粒细胞型亚群的优先扩增 [33]。不出所料，流式细胞术结果显示，CD11b high LY6C + 单核型 MDSCs 的比例没有明显变化，仅占 MDSCs 的一小部分（图 4a）。然而，在脾脏和肿瘤组织中，NLRP3 炎症小体阻断后，LY6G + 粒细胞型 MDSCs 的比例显著降低（图 4b, c），我们观察到粒细胞型 MDSCs 的比例高于单核型 MDSCs（图 4a–c）。此外，免疫荧光染色进一步证实，MCC950 治疗可以减少肿瘤微环境中 CD11b + LY6G @10# 粒细胞型 MDSCs 的群体（图 4e, f）。 CCL2 和 CXCL1 是招募 MDSCs 和 TAMs 的关键趋化因子[34, 35]。Western blot 分析支持了 CCL2 和 CXCL1 表达降低的发现，伴随着小鼠肿瘤组织中 IL-1β的减少（图 4d）。同样，我们注意到在 NLRP3 失活后 TAMs 的数量呈下降趋势，这种下降趋势在 15 mg/kg MCC950 处理组中更为明显（图 5a）。然而，这种变化仅在肿瘤组织中统计学上显著（图 5b）。此外，由于肿瘤细胞与免疫细胞之间的 CD47-SIRPα轴是肿瘤免疫逃逸的重要分子模式，阻断这一信号可以增强肿瘤细胞的吞噬作用[36]，我们进行了 Western blot 和免疫荧光实验来检测 CD47-SIRPα轴蛋白的表达水平。结果显示，MCC950 处理显著降低了 2cKO 肿瘤携带小鼠肿瘤组织中 CD47 和 SIRPα的表达水平（图 5c）；免疫荧光结果也证实了这一发现（图 5d）。
图 4。
阻断 NLRP3 炎性小体激活的 MCC950 可以有效地减少 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠模型中髓系衍生的抑制细胞的招募。a 从对照和 MCC950 处理的 2cKO 肿瘤携带小鼠中分离出的髓系衍生抑制细胞的流式细胞术点图。b, c 统计和分析显示 MCC950 治疗减少了 HNSCC 小鼠脾脏和肿瘤中髓系衍生抑制细胞的数量（数据表示为平均值±标准误差）。d 在给予 HNSCC 小鼠 PBS 或抗 NLRP3 激活治疗后，通过 Western blot 分析肿瘤中 IL-1β和与髓系衍生抑制细胞相关的细胞因子 CCL2 和 CXCL1 的表达。e 代表控制或 MCC950 处理的小鼠肿瘤组织中粒细胞衍生的抑制细胞（CD11b + Ly6G + ）的免疫荧光显微镜图像。CD11b 红色，Ly6G 绿色，DAPI 蓝色；标尺=50 μm。f 三组中 CD11b-和 Ly6G 阳性细胞的定量分析（数据表示为平均值±标准误差）。在直方图中，灰色=对照组，黄色=10 mg/kg MCC950 组，蓝色=15 mg/kg MCC950 组
图 5。
MCC950 治疗在头颈鳞状细胞癌小鼠模型的肿瘤微环境中显著降低了 TAMs 的数量。a DLN 中对照组和 MCC950 处理组与 CD11b + F4/80 + 相关的肿瘤相关巨噬细胞的流式细胞术点图。b 在四块组织中的 2cKO 肿瘤携带小鼠中，TAM 积聚的量化和显著差异（数据表示为平均值±SEM）。c 西方印迹分析显示，MCC950 治疗后 Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠肿瘤中 SIRPα和 CD47 的表达水平明显降低。d PBS 或 MCC950 处理的小鼠肿瘤组织的代表性免疫荧光显微镜图像；标尺=50 μm
NLRP3 炎症体的阻断增加了小鼠头颈鳞状细胞癌模型中有效 CD4 和 CD8T 细胞的数量
我们的前期研究证实，2cKO 肿瘤携带小鼠处于免疫抑制状态，与野生型小鼠相比，CD4 + 和 CD8 + T 细胞的数量呈下降趋势，而 PD-1-或 Tim3-耗竭 T 细胞的数量呈上升趋势 [20, 21]。基于这些发现，我们使用流式细胞术检测了 MCC950 治疗后这些 T 细胞的比例变化（图 6a）。我们发现，当小鼠以 10 mg/kg 的剂量接受 MCC950 治疗时，DLN 中的 CD4 + T 细胞和脾脏中的 CD8 + T 细胞的数量显著增加。当小鼠以 15 mg/kg 的剂量接受 MCC950 治疗时，脾脏、DLN 和血液中的 CD4 + 和 CD8 + T 细胞的数量也显著增加（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; 图 6a, b）。相反，当小鼠以 10 mg/kg 的剂量接受 MCC950 治疗时，脾脏和 DLN 中的 PD-1 + CD4 + T 细胞和 Tim3 + CD4 + T 细胞的数量减少，而脾脏和血液中的 PD-1 + CD8 + T 细胞和 DLN 和血液中的 Tim3 + CD8 + T 细胞的数量在 10 mg/kg MCC950 组中也减少。 此外，在接受 15 mg/kg MCC950 治疗的小鼠中，在脾脏、DLN 和血液中观察到 PD-1 + 和 Tim3 + T 细胞显著减少（*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；图 6c, d）。此外，免疫化学显示，在 MCC950 治疗后，肿瘤组织中的 CD4 + 和 CD8 + T 细胞数量增加（图 6e, f），并且与对照组相比，MCC950 治疗后 PD-1-和 Tim3 阳性细胞的数量显著减少（图 6e, f）。
图 6。
NLRP3 炎症复合体的失活增加了效应 T 细胞并减少了耗竭 T 细胞在 Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠中。a PBS 或 MCC950 处理的小鼠脾脏中效应 CD4 + 和 CD8 + T 细胞、PD-1 + T 细胞和 Tim3 + T 细胞群体的流式细胞术分析。b 脾脏、DLN 和血液中 CD4 + （红色）和 CD8 + （蓝色）T 细胞的定量和统计分析（M10 = 10 mg/kg MCC950；M15 = 15 mg/kg MCC950，*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001）。c 三组中 CD4 + （红色）和 CD8 + （蓝色）T 细胞中 PD-1 + T 细胞比例的定量和统计分析结果（*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001）。d 三组中 CD4 + （红色）和 CD8 + （蓝色）T 细胞中 Tim3 + T 细胞比例的变化（*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001）。e, f PBS 或 MCC950 处理后 Tgfbr1/Pten 2cKO 小鼠肿瘤组织的代表性免疫组织化学染色和 CD4、CD8、PD-1 和 Tim3 的定量；刻度尺=50 μm，箭头指向阳性染色
NLRP3 炎症小体的表达与人类 HNSCC 中的 CD4、CD8、Tregs、MDSCs、TAMs 和免疫检查点蛋白 PD-1、Tim3 正相关
为了进一步探讨人类 HNSCC 中 NLRP3 炎症小体的临床意义，我们分析了人类 HNSCC 组织阵列（12 份口腔黏膜样本，38 例不典型增生病例和 64 例 HNSCC 病例）中 NLRP3 炎症小体与 Tregs、CD4、CD8、MDSCs、TAMs 以及免疫检查点蛋白 PD-1 和 Tim3 之间的关系。通过免疫组织化学分析，我们发现 NLRP3 炎症小体与以下表达呈正相关：CD4 表达（p < 0.001，r = 0.3884），CD8 表达（p < 0.01，r = 0.2752），Treg 标志物 Foxp3（p < 0.001，r = 0.4081），MDSC 标志物 CD11b 和 CD33（p < 0.001，r = 0.3925；p < 0.001，r = 0.3535），TAM 标志物 CD68 和 CD163（p = 0.001，r = 0.3514；p < 0.01，r = 0.2934），PD-1（p < 0.05，r = 0.2053）和 Tim3（p < 0.001，r = 0.4209）（图 7a, b）。有趣的是，NLRP3 炎症小体成分 caspase-1、ASC 和 IL-18 的表达也与这些蛋白的表达密切相关（图 S2）。层次聚类分析为我们提供了这些蛋白之间相关性的直观理解（图 7c）。 上述数据证实，NLRP3 炎症复合体与效应 CD4 和 CD8T 细胞、Tregs、MDSCs、TAMs 以及免疫检查点蛋白 PD-1 和 Tim3 相关。
图 7。
NLRP3 炎症复合体的表达模式与人类 HNSCC 组织中 CD4、CD8、PD-1、Tim3 和 Treg、MDSC 和 TAM 相关蛋白的表达模式存在相关性。a 对人类 HNSCC 组织（组织微阵列，患者编号 57）中 NLRP3 炎症复合体成分和 CD4、CD8、Fopx3、CD11b、CD33、CD68、CD163、PD-1 和 Tim3 进行免疫组织化学染色的连续切片；比例尺=50 μm。b Spearman 秩相关系数测试和线性趋势测试显示，NLRP3 的表达显著且与 CD4（p < 0.001，r = 0.3883）、CD8（p < 0.01，r = 0.2752）、Foxp3（p < 0.001，r = 0.4081）、CD11b（p < 0.001，r = 0.3925）、CD33（p < 0.001，r = 0.3535）、CD68（p < 0.001，r = 0.3514）、CD163（p < 0.01，r = 0.2934）、PD-1（p < 0.05，r = 0.2053）和 Tim3（p < 0.001，r = 0.4209）呈正相关。c 这些标记在 HNSCC 组织微阵列中的表达模式的层次聚类图，包含 64 例 HNSCC，12 例不典型增生，38 例黏膜组织。
NLRP3 炎症体蛋白在人类 HNSCC 和 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠中均上调（图 1）。除了这一发现，我们通过查询公开可用的 TCGA 数据库发现，头颈鳞状细胞癌中 IL-1B mRNA 水平与 NLRP3 表达密切相关（图 S1b，p < 0.001，r = 0.3558）。然而，考虑到使用 MCC950 阻断 NLRP3 炎症体激活仅减少了炎性因子的分泌[37]，因此，当小鼠接受 MCC950 治疗时，观察到最直接的效果，即减少了 IL-1β的分泌。这一效果伴随着炎症环境的改善，减缓了肿瘤的进展。因此，我们推测，通过抑制 NLRP3 炎症体，MCC950 治疗在这一 HNSCC 小鼠模型（Tgfbr1/Pten 2cKO）中增强了抗肿瘤免疫，实现了对 NLRP3 炎症体的抑制。
讨论
目前，慢性炎症被认为是一种肿瘤促进剂，导致免疫抑制状态[18]，各种细胞因子或趋化因子刺激免疫抑制细胞的产生和招募[18, 38]。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种免疫抑制和炎症相关的肿瘤类型[11, 39]，NLRP3 炎症小体被认为是先天免疫中最广泛的有害刺激传感器[40]。然而，到目前为止，炎症微环境与肿瘤免疫之间的关系尚未完全理解。我们之前的研究表明，NLRP3 炎症小体在 HNSCC 中促进肿瘤的发生[41]。在本研究中，我们揭示了人类和小鼠 HNSCC 中 NLRP3 炎症小体/IL-1β途径的激活提供了一个炎症微环境，促进了 HNSCC 的进展。结果显示，NLRP3 炎症小体的激活，通过 MCC950 抑制，导致 IL-1β分泌减少和自发性 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠肿瘤发生延迟。 抑制 NLRP3 炎症小体也减少了免疫抑制细胞的浸润，如 Tregs、MDSCs 和 TAMs，并通过增加 TILs 和减少 PD-1-和 Tim3 耗竭的 T 细胞来增强 T 细胞功能。此外，根据人类 HNSCC 组织阵列，NLRP3 炎症小体的表达与 CD4、CD8、Foxp3、CD11b、CD33、CD68、CD163、PD-1 和 Tim3 的表达相关。
NLRP3 炎症体在癌症免疫中被认为是双刃剑[4]，它可以帮助身体去除有害病原体，但也可以在各种肿瘤中被激活并促进肿瘤发展。一方面，NLRP3 炎症体的作用具有组织特异性[42, 43]；因此，在考虑癌症发展时，必须考虑组织类型。另一方面，由于 NLRP3 炎症体组成部分的复杂性，每个组成部分在肿瘤中的作用并不相同：IL-1β被报道促进肿瘤生长，但胃癌小鼠中缺乏 IL-18、ASC 和 caspase-1 增加了肿瘤的可能性[43–45]。此外，NLRP3 炎症体是先天免疫的重要组成部分，可以感知各种信号，包括与癌细胞无关的信号[5]。因此，NLRP3 炎症体确实为癌症治疗提供了有前景的目标，但需要更多的研究来确定 NLRP3 炎症体在癌症发展和进展期间的具体分子机制。 IL-1β和 IL-18 是 NLRP3 炎症体的主要下游产物；然而，IL-18 在肿瘤发生中的作用存在争议。IL-18 的激活可能促进肿瘤发展，或者相反，通过激活 NK 和 T 细胞反应增强抗肿瘤免疫，限制肿瘤生长[46]。据报道，在 IL-18 KO 小鼠中，肿瘤生长并未减少，但随着 IL-1β的减少，肿瘤生长可以减少[16]，并且有大量证据表明 IL-1β是一种促肿瘤细胞因子[16, 47]。鉴于这些因素，我们的工作集中在 IL-1β上。炎症体不仅在基质细胞中表达，也在癌细胞中表达，因此这些“新的传感器”在肿瘤部位将通过激活 NLRP3 炎症体产生大量异常 IL-1β。在本报告中，发现 HNSCC 患者血清和 HNSCC 小鼠模型的多个组织中 IL-1β过表达，这表明 IL-1β可能是促进 HNSCC 生长的关键成分。 后续研究基于选择性的小分子抑制剂 MCC950，该抑制剂通过抑制 ASC 寡聚化而非降低 NLRP3 炎症小体蛋白表达来抑制 NLRP3 炎症小体，从而减少 IL-1β的产生[37]。我们的研究表明，降低 IL-1β可以有效地减缓 HNSCC 小鼠肿瘤负担的速度。
Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠模型中发生的多种肿瘤发生机制使其适合研究人类 HNSCC [24]。与人类 HNSCC 类似，携带 2cKO 肿瘤的小鼠的免疫系统也处于抑制状态，并且 MDSC、Treg 和 TAM 亚群的积累特征明显 [21]。研究发现，IL-1β可以增加 MDSC 的数量 [47]，这损害了乳腺和胃癌的免疫功能 [37]，影响了肺癌小鼠模型中 TAM 的数量 [48]，并与黑色素瘤中 Tregs 的增加有关 [49]。Guo 等人发现，NLRP3 炎性小体/IL-1β途径促进了肿瘤生长和转移，并可能解释了肿瘤环境中 MDSC 和 TAM 的招募 [16]。然而，高 IL-1β与 HNSCC 中免疫抑制细胞的存在之间的关系尚不清楚。在本研究中，抑制 NLRP3 炎性小体导致 HNSCC 小鼠模型中 IL-1β的浓度急剧下降，并减少了免疫抑制细胞的数量。 血液、脾脏和肿瘤样本中的 CD4 + Foxp3 + CD25 + 常规 T 细胞数量显著减少。有趣的是，我们发现 CD11b + LY6G + LY6C low 粒细胞 MDSCs 的数量明显变化，而不是 CD11b + LY6G − LY6C high 单核细胞 MDSCs，这与当前报告一致，即 LY6C low 粒细胞 MDSCs 在肿瘤中占主导地位，并且它们在体内外抑制 NK 细胞[50]。TAMs 在肿瘤的发生发展中扮演重要角色，其浸润与 HNSCC 患者的预后不良相关[51]。TAMs 是 IL-1β的主要产生者之一，炎症环境也可以促进 TAMs 的招募[47]。最近的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞通过 NLRP3/IL-1β途径促进转移[52]。此外，CCL2 和 CXCL1 chemokines 对于 MDSCs 和 TAMs 的招募至关重要[34, 53]，MCC950 处理的小鼠中 CCL2 和 CXCL1 的减少也支持了我们的结果。 CD47/SIPα轴在恶性肿瘤中作为“不要吃我”的信号，可能促进肿瘤免疫逃逸，抑制这一途径可以增强巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用 [36]。结果显示，MCC950 治疗可能在不同的外周免疫器官和循环中产生不同的效果，但其背后的机制仍然不清楚。
近期，基于免疫检查点的新兴免疫疗法在未来的癌症治疗中展现出有希望的前景。程序性死亡-1（PD-1）和 T 细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（Tim3）在 TILs 上表达，普遍认为 PD-1 或 Tim3 的表达会损害 T 细胞功能[54]；当在肿瘤细胞中识别出 PD-1/Tim3 阳性 T 细胞时，可能会发生肿瘤逃逸[54]。在本研究中，我们发现当抑制 NLRP3 炎性小体/IL-1β途径时，CD4 + 和 CD8 + T 细胞的群体显著增加，PD-1-和 Tim3 阳性 T 细胞的数量显著减少。我们的结果表明，在接受 MCC950 治疗后，耗竭 T 细胞的数量和对 T 细胞的损害减少。
总结，我们证明了 NLRP3 炎症小体/IL-1β信号通路诱导炎症微环境，促进肿瘤的发生和头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的发展。NLRP3 炎症小体抑制延迟了肿瘤生长，并通过减少免疫抑制细胞的数量和增强效应 T 细胞的功能，重塑了抗肿瘤反应。在 Tgfbr1/Pten 2cKO HNSCC 小鼠模型中，这些数据表明，通过 NLRP3 炎症小体/IL-1β途径抑制肿瘤微环境可能为 HNSCC 治疗提供一种新的方法。
电子补充材料
以下是电子补充材料的链接。
补充图 1。a 头颈癌与正常黏膜的 IL-1B mRNA 表达水平在多个数据集中的比较。b TCGA 数据集中的 IL-1B mRNA 表达与 NLRP3 密切相关（p < 0.001，r = 0.3558）（TIFF 1065 kb）
补充图 2。人类头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中 ASC、caspase-1 和 IL-18 的表达与 CD8、PD-1、Tim3 和 Treg、MDSC、TAM 标记相关（TIFF 11065 kb）
致谢
这项工作由中国国家自然科学基金 81402241，81672667，81672668，81472528，81472529 资助。
缩写
- NLRP3
Nod-like 受体蛋白 3- HNSCC
头颈鳞状细胞癌- 病症
翻译文本：异型增生
- IL-1β
白细胞介素（IL）-1β
- TILs
肿瘤浸润淋巴细胞- Tregs
监管 T 细胞
- TCGA
癌症基因图谱
- MDSCs
髓系衍生抑制细胞- TAMs
肿瘤相关巨噬细胞- PD-1
程序性死亡-1
- Tim3
T 细胞免疫球蛋白粘蛋白-3- ELISA
酶联免疫吸附测定
遵守道德标准
伦理标准
动物研究由武汉大学口腔医院的动物福利与使用委员会批准和监督。所有人体研究在试验开始时从患者处获得了知情同意，并由武汉大学口腔医院的医学伦理委员会批准。伦理批准号为 2014C66。
利益冲突
作者声明他们没有任何利益冲突。
脚注
雷陈和黄丛发对本研究贡献等同。
参考文献
- 1.Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 2010;140(6):883–899. doi: 10.1016/j.cell.2010.01.025. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Coussens LM, Zitvogel L, Palucka AK. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet? Science. 2013;339(6117):286–291. doi: 10.1126/science.1232227. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Próchnicki T, Mangan MS, Latz E. Recent insights into the molecular mechanisms of the NLRP3 inflammasome activation. F1000Res. 2016;5:1469. doi: 10.12688/f1000research.8614.1. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Kolb R, Liu GH, Janowski AM, Sutterwala FS, Zhang W. Inflammasomes in cancer: a double-edged sword. Protein Cell. 2014;5(1):12–20. doi: 10.1007/s13238-013-0001-4. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Menu P, Vince JE. The NLRP3 inflammasome in health and disease: the good, the bad and the ugly. Clin Exp Immunol. 2011;166(1):1. doi: 10.1111/j.1365-2249.2011.04440.x. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Li Y, Wang L, Pappan L, Galliher-beckley A, Shi J. IL-1β promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 2012;11(1):87. doi: 10.1186/1476-4598-11-87. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Abrahamsson A, Morad V, Saarinen NM, Dabrosin C. Estradiol, tamoxifen, and flaxseed alter IL-1β and IL-1Ra levels in normal human breast tissue in vivo. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(11):2044–2054. doi: 10.1210/jc.2012-2288. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Chen W, Zheng R, Baade PD, Zhang S, Zeng H, Bray F, Jemal A, Yu XQ, He J. Cancer statistics in China. CA Cancer J Clin. 2016;66(2):115–132. doi: 10.3322/caac.21338. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Hunter KD, Parkinson EK, Harrison PR. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 2005;5(2):127–135. doi: 10.1038/nrc1549. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Warnakulasuriya S. Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer. Oral Oncol. 2009;45(4–5):309. doi: 10.1016/j.oraloncology.2008.06.002. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Ferris RL. Immunology and immunotherapy of head and neck cancer. J Clin Oncol. 2015;33(29):3293. doi: 10.1200/JCO.2015.61.1509. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Ferris RL, Whiteside TL, Ferrone S. Immune escape associated with functional defects in antigen-processing machinery in head and neck cancer. Clin Cancer Res. 2006;12(13):3890–3895. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-05-2750. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Dasgupta S, Bhattacharyachatterjee M, O’Malley BW, Jr, Chatterjee SK. Inhibition of NK cell activity through TGF-beta 1 by down-regulation of NKG2D in a murine model of head and neck cancer. J Immunol. 2005;175(8):5541–5550. doi: 10.4049/jimmunol.175.8.5541. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Kuss I, Hathaway B, Ferris RL, Gooding W, Whiteside TL. Decreased absolute counts of T lymphocyte subsets and their relation to disease in squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res. 2004;10(11):3755–3762. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-0054. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Economopoulou P, Kotsantis I, Psyrri A. Checkpoint inhibitors in head and neck cancer: rationale, clinical activity, and potential biomarkers. Curr Treat Options Oncol. 2016;17(8):40. doi: 10.1007/s11864-016-0419-z. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Guo B, Fu S, Zhang J, Liu B, Li Z. Targeting inflammasome/IL-1 pathways for cancer immunotherapy. Sci Rep. 2016;6:36107. doi: 10.1038/srep36107. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Gajewski TF, Woo SR, Zha Y, Spaapen R, Zheng Y, Corrales L, Spranger S. Cancer immunotherapy strategies based on overcoming barriers within the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol. 2013;25(2):268–276. doi: 10.1016/j.coi.2013.02.009. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Kanterman J, Sadefeldman M, Baniyash M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 2012;22(4):307–318. doi: 10.1016/j.semcancer.2012.02.008. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Bruchard M, Mignot G, Derangère V, Chalmin F, Chevriaux A, Végran F, Boireau W, Simon B, Ryffel B, Connat JL. Chemotherapy-triggered cathepsin B release in myeloid-derived suppressor cells activates the Nlrp3 inflammasome and promotes tumor growth. Nat Med. 2013;19(1):57–64. doi: 10.1038/nm.2999. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Yu GT, Bu LL, Zhao YY, Mao L, Deng WW, Wu TF, Zhang WF, Sun ZJ. CTLA4 blockade reduces immature myeloid cells in head and neck squamous cell carcinoma. Oncoimmunology. 2016;5(6):e1151594. doi: 10.1080/2162402X.2016.1151594. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Deng WW, Mao L, Yu GT, Bu LL, Ma SR, Liu B, Gutkind JS, Kulkarni AB, Zhang WF, Sun ZJ. LAG-3 confers poor prognosis and its blockade reshapes antitumor response in head and neck squamous cell carcinoma. Oncoimmunology. 2016;5(11):e1239005. doi: 10.1080/2162402X.2016.1239005. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.Moynihan KD, Opel CF, Szeto GL, Tzeng A, Zhu EF, Engreitz JM, Williams RT, Rakhra K, Zhang MH, Rothschilds AM, Kumari S, Kelly RL, Kwan BH, Abraham W, Hu K, Mehta NK, Kauke MJ, Suh H, Cochran JR, Lauffenburger DA, Wittrup KD, Irvine DJ. Eradication of large established tumors in mice by combination immunotherapy that engages innate and adaptive immune responses. Nat Med. 2016;22(12):1402–1410. doi: 10.1038/nm.4200. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Yu GT, Bu LL, Huang CF, Zhang WF, Chen WJ, Gutkind JS, Kulkarni AB, Sun ZJ. PD-1 blockade attenuates immunosuppressive myeloid cells due to inhibition of CD47/SIRPα axis in HPV negative head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2015;6(39):42067–42080. doi: 10.18632/oncotarget.5955. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Bian Y, Hall B, Sun ZJ, Molinolo A, Chen W, Gutkind JS, Waes CV, Kulkarni AB. Loss of TGF-β signaling and PTEN promotes head and neck squamous cell carcinoma through cellular senescence evasion and cancer-related inflammation. Oncogene. 2012;31(28):3322–3332. doi: 10.1038/onc.2011.494. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(25):14863–14868. doi: 10.1073/pnas.95.25.14863. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 26.Saldanha AJ. Java Treeview—extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 2004;20(17):3246–3248. doi: 10.1093/bioinformatics/bth349. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 27.Peng CH, Liao CT, Peng SC, Chen YJ, Cheng AJ, Juang JL, Tsai CY, Chen TC, Chuang YJ, Tang CY, Hsieh WP, Yen TC. A novel molecular signature identified by systems genetics approach predicts prognosis in oral squamous cell carcinoma. PLoS One. 2011;6(8):e23452. doi: 10.1371/journal.pone.0023452. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 28.Ye H, Yu T, Temam S, Ziober BL, Wang J, Schwartz JL, Mao L, Wong DT, Zhou X. Transcriptomic dissection of tongue squamous cell carcinoma. BMC Genom. 2008;9(1):69. doi: 10.1186/1471-2164-9-69. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 29.Ginos MA, Page GP, Michalowicz BS, Patel KJ, Volker SE, Pambuccian SE, Ondrey FG, Adams GL, Gaffney PM. Identification of a gene expression signature associated with recurrent disease in squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer Res. 2004;64(1):55. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-03-2144. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 30.Putz G, Rosner AI, Schmitz N, Buchholz F. AML1 deletion in adult mice causes splenomegaly and lymphomas. Oncogene. 2006;25(6):929–939. doi: 10.1038/sj.onc.1209136. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 31.Xie P, Stunz LL, Larison KD, Yang B, Bishop GA. TRAF3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 2007;27(2):253–267. doi: 10.1016/j.immuni.2007.07.012. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 32.Zou W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2006;6(4):295. doi: 10.1038/nri1806. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 33.Je-In Youn SN, Collazo Michelle, Gabrilovich Dmitry I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 2008;181(8):5791–5802. doi: 10.4049/jimmunol.181.8.5791. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 34.Chang AL, Miska J, Wainwright DA, Dey M, Rivetta CV, Yu D, Kanojia D, Pituch KC, Qiao J, Pytel P. CCL2 produced by the glioma microenvironment is essential for the recruitment of regulatory T cells and myeloid-derived suppressor cells. Cancer Res. 2016;76(19):5671. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-0144. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 35.Sander LE, Sackett SD, Dierssen U, Beraza N, Linke RP, Müller M, Blander JM, Tacke F, Trautwein C. Hepatic acute-phase proteins control innate immune responses during infection by promoting myeloid-derived suppressor cell function. J Exp Med. 2010;207(7):1453–1464. doi: 10.1084/jem.20091474. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 36.Mccracken MN, Cha AC, Weissman IL. Molecular pathways: activating T cells after cancer cell phagocytosis from blockade of CD47 “don’t eat me” signals. Clin Cancer Res. 2015;21(16):3597–3601. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-2520. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 37.Shao BZ, Xu ZQ, Han BZ, Su DF, Liu C. NLRP3 inflammasome and its inhibitors: a review. Front Pharmacol. 2015;6:262. doi: 10.3389/fphar.2015.00262. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 38.Solito S, Marigo I, Pinton L, Damuzzo V, Mandruzzato S, Bronte V. Myeloid-derived suppressor cell heterogeneity in human cancers. Ann N Y Acad Sci. 2014;1319(1):47–65. doi: 10.1111/nyas.12469. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 39.Yang X, Lu H, Yan B, Romano RA, Bian Y, Friedman J, Duggal P, Allen C, Chuang R, Ehsanian R. ΔNp63 versatilely regulates a Broad NF-κB gene program and promotes squamous epithelial proliferation, migration, and inflammation. Cancer Res. 2011;71(10):3688–3700. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3445. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 40.Guo H, Callaway JB, Ting JP. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 2015;21(7):677. doi: 10.1038/nm.3893. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 41.Huang CF, Chen L, Li YC, Wu L, Yu GT, Zhang WF, Sun ZJ. NLRP3 inflammasome activation promotes inflammation-induced carcinogenesis in head and neck squamous cell carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2017;36(1):116. doi: 10.1186/s13046-017-0589-y. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 42.Okamoto M, Liu W, Luo Y, Tanaka A, Cai X, Norris DA, Dinarello CA, Fujita M. Constitutively active inflammasome in human melanoma cells mediating autoinflammation via caspase-1 processing and secretion of interleukin-1beta. J Biol Chem. 2010;285(9):6477–6488. doi: 10.1074/jbc.M109.064907. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 43.Allen IC, TeKippe EM, Woodford RM, Uronis JM, Holl EK, Rogers AB, Herfarth HH, Jobin C, Ting JP. The NLRP3 inflammasome functions as a negative regulator of tumorigenesis during colitis-associated cancer. J Exp Med. 2010;207(5):1045–1056. doi: 10.1084/jem.20100050. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 44.Zaki MH, Vogel P, Bodymalapel M, Lamkanfi M, Kanneganti TD. IL-18 production downstream of the Nlrp3 inflammasome confers protection against colorectal tumor formation. J Immunol. 2010;185(8):4912. doi: 10.4049/jimmunol.1002046. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 45.Dupaul-Chicoine J, Yeretssian G, Doiron K, Bergstrom KSB, Meunier C, Gros P, Vallance BA, Saleh M, Mcintire CR, Leblanc PM. Control of intestinal homeostasis, colitis, and colitis-associated colorectal cancer by the inflammatory caspases. Immunity. 2010;32(3):367. doi: 10.1016/j.immuni.2010.02.012. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 46.Fabbi M, Carbotti G, Ferrini S. Context-dependent role of IL-18 in cancer biology and counter-regulation by IL-18BP. J Leukoc Biol. 2015;97(4):665. doi: 10.1189/jlb.5RU0714-360RR. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 47.Tu S, Bhagat G, Cui G, Takaishi S, Kurt-Jones EA, Rickman B, Betz KS, Penz-Oesterreicher M, Bjorkdahl O, Fox JG, Wang TC. Overexpression of interleukin-1beta induces gastric inflammation and cancer and mobilizes myeloid-derived suppressor cells in mice. Cancer Cell. 2011;14(5):408–419. doi: 10.1016/j.ccr.2008.10.011. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 48.Terlizzi M, Colarusso C, Popolo A, Pinto A, Sorrentino R. IL-1α and IL-1β-producing macrophages populate lung tumor lesions in mice. Oncotarget. 2016;7(36):58181–58182. doi: 10.18632/oncotarget.11276. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 49.Jiang H, Gebhardt C, Umansky L, Beckhove P, Schulze TJ, Utikal J, Umansky V. Elevated chronic inflammatory factors and myeloid-derived suppressor cells indicate poor prognosis in advanced melanoma patients. Int J Cancer. 2015;136(10):2352–2360. doi: 10.1002/ijc.29297. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 50.Elkabets M, Ribeiro VS, Dinarello CA, Ostrand-Rosenberg S, Di SJ, Apte RN, Vosshenrich CA. IL-1β regulates a novel myeloid-derived suppressor cell subset that impairs NK cell development and function. Eur J Immunol. 2010;40(12):3347–3357. doi: 10.1002/eji.201041037. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 51.Balermpas P, Rödel F, Liberz R, Oppermann J, Wagenblast J, Ghanaati S, Harter PN, Mittelbronn M, Weiss C, Rödel C. Head and neck cancer relapse after chemoradiotherapy correlates with CD163+ macrophages in primary tumour and CD11b+ myeloid cells in recurrences. Br J Cancer. 2014;111(8):1509. doi: 10.1038/bjc.2014.446. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 52.Weichand B, Popp R, Dziumbla S, Mora J, Strack E, Elwakeel E, Frank A, Scholich K, Pierre S, Syed S. S1PR1 on tumor-associated macrophages promotes lymphangiogenesis and metastasis via NLRP3/IL-1β. J Exp Med. 2017;214(9):2695–2713. doi: 10.1084/jem.20160392. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 53.Zarif JC, Taichman RS, Pienta KJ. TAM macrophages promote growth and metastasis within the cancer ecosystem. Oncoimmunology. 2014;3(7):e941734. doi: 10.4161/21624011.2014.941734. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 54.Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2012;12(4):252–264. doi: 10.1038/nrc3239. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Associated Data
This section collects any data citations, data availability statements, or supplementary materials included in this article.
Supplementary Materials
Supplementary Fig. 1. a IL-1B mRNA expression levels from several datasets for Head–Neck cancer versus normal mucosa counterpart. b IL-1B mRNA expression was closely related to NLRP3 in TCGA dataset (p < 0.001, r = 0.3558) (TIFF 1065 kb)
Supplementary Fig. 2. The expression of ASC, caspase-1, and IL-18 were correlated with CD8, PD-1, Tim3 and Treg, MDSC, TAM markers in human HNSCC (TIFF 11065 kb)