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系列适应性实验室进化增强大肠杆菌的混合碳代谢能力


Kangsan Kim a , b a , b ^(a,b){ }^{\mathrm{a}, \mathrm{b}} 、Donghui Choe c c ^(c){ }^{\mathrm{c}} 、Minjeong Kang a , b a , b ^(a,b){ }^{\mathrm{a}, \mathrm{b}} 、Sang-Hyeok Cho a , b a , b ^(a,b){ }^{\mathrm{a}, \mathrm{b}} 、Suhyung Cho b b ^(b){ }^{\mathrm{b}} 、Ki Jun Jeong b , d , e b , d , e ^(b,d,e){ }^{\mathrm{b}, \mathrm{d}, \mathrm{e}} 、Bernhard Palsson c , f c , f ^(c,f){ }^{\mathrm{c}, \mathrm{f}} 、Byung-Kwan Cho a , b , e , a , b , e , ^(a,b,e,^(**)){ }^{\mathrm{a}, \mathrm{b}, \mathrm{e},{ }^{*}}

a a ^(a){ }^{a} 韩国科学技术高等研究院生物科学系,大田,34141,大韩民国

b b ^(b){ }^{\mathrm{b}} KAIST生物世纪研究所,韩国科学技术高等研究院,大田,34141,韩国

c ^("c "){ }^{\text {c }} 美国加州圣地亚哥大学生物工程系,拉霍亚,CA,92093

d ^("d "){ }^{\text {d }} 韩国科学技术高等研究院化学和生物分子工程系,大田,34141,大韩民国

e e ^(e){ }^{e} 韩国科学技术高等研究院工程生物学研究生院,大田,34141,大韩民国

f f ^(f){ }^{\mathrm{f}} 儿科,加州圣地亚哥大学,拉霍亚,CA,92093,美国

 产品信息

 保留字:


实验室适应性进化

 生物生产
 混合碳
 系统生物学

 摘要


微生物具有利用各种碳源的固有能力,但由于代谢效率低,它们往往表现出低于标准的适应性。为了测试细菌菌株是否可以最佳地利用多种碳源,大肠杆菌在L-乳酸盐和甘油中连续进化。这产生了两个终点菌株,它们首先在L-乳酸中进化,然后在甘油中进化,反之亦然。在碳源专家和多面手突变体的协同作用下,终点菌株在单一和混合适应性碳源上表现出普遍的生长优势。仅 g l p K , p p s A , y d c I g l p K , p p s A , y d c I glpK,ppsA,ydcIg l p K, p p s A, y d c I r p h p y r E r p h p y r E rph-pyrEr p h-p y r E 的四个变体的组合占了超过 80 % 80 % 80%80 \% 的终点菌株适应性。此外,机器学习分析揭示了赋予基因表达的条件特异性调节的转录调节因子的协调活性。 在单碳和混合碳培养条件下,连续自适应实验室进化(ALE)计划在生物生产应用中的有效性进行了评估,其中连续ALE菌株表现出上级的生产力的乙偶姻相比,祖先菌株。总之,系统水平的分析阐明了系列进化的分子基础,这在生物生产应用中具有潜在的实用性。

 1.介绍


主力微生物具有多功能的代谢能力,允许吸收和转化不同的化学物质从一种形式到另一种形式。这种代谢的多功能性长期以来一直被用于生物化学品的生产(Lee等人,2019),现在越来越多地用于可再生废物的生物转化,以满足日益增长的可持续性需求(Zhang et al.,2016年)的报告。微生物生物转化通常需要使用功能通用的细菌来转化低价值的生物质,例如工业副产物(Kim等人,2022)、微生物发酵废物(Seong等人,2020)和其他固体废物(Zhang et al.,2016年,成为增值产品。

然而,由微生物代谢的碳底物的分解代谢效率变化很大,导致取决于所用碳源的类型的不同的生物化学生产产率(Lee等人,2019年)。与单糖不同,微生物对替代碳的适应性


碳源通常是次优的,并且必须克服几种碳化合物的固有毒性以实现有效的生物转化。例如,E.大肠杆菌菌株K-12在甘油中表现出次优适应性(Ibarra等,2002),可能是由于限制甘油摄取的有毒中间体(Booth 2005),但是这种次优表型可以通过ALE(也称为实验进化)重新配置(Jin et al.,1983年)。出于这个原因,替代碳源的微生物生物转化通常伴随着ALE以提高底物利用率和生物转化效率(Kim等人,2023年)。

ALE利用自然进化的原理,在特定的选择压力下通过持续繁殖选择具有所需性状的后代。ALE在菌株优化中的稳健性由已经持续超过30年的开创性长期进化实验例示,其突出了微生物探索和获得有益于存活的突变的未开发潜力(Barrick等人,2020年; Good等人,2017年)的报告。自适应
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.04.004

接收日期:2024年1月12日;接收日期:2024年3月31日;接受日期:2024年4月14日


2024年4月16日网上发售


1096-7176/© 2024国际代谢工程学会。爱思唯尔公司出版All rights reserved.


突变通过各种机制,例如潜在基因和途径的激活,赋予适合性益处(Jin等人,1983)以及调节的重新布线(Conrad等人,2010)和代谢网络(Cheng等人,2014年)。这些变化最终引导进化的种群走向最佳适应性。

迄今为止,基于ALE的适应性优化已经在单一或多种碳源的存在下进行,阐明了适应性策略的一般性和适应菌株的潜在工业相关性(Sandberg等人,2017; Saxer等人,2010年)。然而,在一个以上的健身景观进行连续适应微生物的进化很少探索。在这里,我们采用系统生物学的方法来研究微生物使用两种不同的替代碳源,甘油和乳酸的系列适应的结果。此外,我们研究了连续进化的E。大肠杆菌在将替代碳源生物转化为增值产品乙偶姻中的应用。目前的研究结果表明,连续ALE可以作为一种有效的工具,利用能够将多种,否则利用效率低下的碳源转化为商品生物化学品的有效菌株。

 2.结果


2.1. E.杆菌


采用ALE对野生型E.大肠杆菌MG 1655在两种不同碳源甘油和L-乳酸盐(下文称为乳酸盐)上的生长(参见图解摘要,图1);大肠杆菌显示出次优生长表型(Fong等,2003; Ibarra等人,2002年)。在指数生长中期连续传代三个独立的群体,以利用生长最快的后代。我们估计了每代的倍增时间作为累积世代的函数,以推断适应性适应性的变化(Kang等人,2019年)。

在ALE的第一阶段,在前300-400代乳酸和甘油适应谱系(下文分别为“LA”和“GL”)中观察到菌株适应性的快速增加。增量斜率在第800代达到稳定,这表明ALE的终点(Sandberg等人,2019年)(图1A)。这种适应性轨迹与我们先前的发现一致,其中800代进化时间尺度为关键有益突变的固定提供了足够的窗口(Kang等人,2019年)。在达到第800代时转换碳源,并且LA和GL谱系在转换的碳源上再繁殖600至800代,直到达到适合度平台。值得注意的是,菌株GL的倍增时间似乎接近于野生型的倍增时间,而菌株LA在碳移位时受到最小的干扰。 我们推断,这种分歧归因于在LA中获得多面手突变体 r p h p y r E r p h p y r E rph-pyrEr p h-p y r E ,这将在随后的部分中进一步描述。总之,系列ALE实验产生了乳酸-甘油(LA-GL)和甘油-乳酸(GL-LA)终点菌株,这些菌株在两种不同的适应性环境中经历了1400至1600代ALE。

接下来,我们测量了终点菌株的比生长速率和碳吸收速率(图1B和C,补充图S1)。首先,与野生型相比,进化菌株LA、GL、LA-GL和GL-LA在其各自的进化培养基中获得了比生长速率(SGR)的统计学显著改善(图1B;表S3)。这种适应性增益与相应培养基中增强的比碳吸收速率(CURs)一致(图1C;表S3)。与图1A中观察到的碳位移后倍增时间的变化一致,甘油进化菌株GL的SGR和CUR显示与野生型相比乳酸盐的统计学显著下降,强烈暗示非进化条件下的适应性权衡。类似地,乳酸盐进化菌株LA的SGR在甘油中比亲本菌株更高,这解释了其适应性在碳位移时的相对适度的扰动(图1B)。 1B和C;表S3)。

其次,系列ALE、GL-LA和LA-GL的终点菌株表现出多面手表型,其特点是甘油和乳酸的适应性均优于上级(图1B和C;表S3)。适应性进化的第二阶段导致了新的碳源上的适应性参数的显着增强,而没有观察到的适应性权衡以前使用的碳源的适应性进化。例如,与其前身菌株LA相比,LA-GL在甘油中的SGR和CUR增加了1.23倍和1.97倍,同时保持其对乳酸的适应性。类似地,与其祖先菌株GL相比,GL-LA在SGR和CUR方面分别表现出1.89倍和1.73倍的增加,而不损害甘油中的适应前适应性(图1B和C;表S3)。 连续进化的菌株LA-GL和GL-LA中的适应性参数的不同之处在于,在甘油和乳酸盐中,LA-GL的SGR高于GL-LA,而CURs和最大细胞密度与GL-LA相比较低(图1A和1B)。S1 A和B)。总之,这些结果表明,在类似的选择条件下,串行ALE可以利用终点谱系具有普遍的增长优势,表现为不同的表型结果,在一个以上的碳源。


2.2.适应性进化第一阶段的突变谱


为了鉴定适应性突变的原因,我们以50代为间隔对进化种群进行了全基因组重测序(图1D和E)。我们在独立的ALE研究中寻找高度复发的突变体,其中平行突变谱表明因果关系。此外,我们还咨询了ALEdb、E. coliALE突变数据库,以深入了解突变的因果关系(Escheuf等,2019年)。

在菌株LA中,显著的致病突变体是代谢和调节基因的突变体,其出现的顺序为rph-pyrE(RNA酶PH/乳清酸磷酸核糖基转移酶)、hfq(RNA结合蛋白)、cyaA(腺苷酸环化酶)、ppsA(磷酸烯醇丙酮酸合成酶)和 y d c I y d c I ydcIy d c I (推定的转录调节因子)(图1 E)。值得注意的是,在rph的 3 3 3^(')3^{\prime} 末端的基因间区域中的69 bp缺失(下文称为rph-pyrE(del)),这是第一个在第50个累积世代达到100%群体频率的突变,这强烈地表明了选择优势。rph-pyrE缺失突变是大肠杆菌中高度重复的突变。大肠杆菌MG 1655在营养有限的条件下,如通过在独立ALE实验中的绝对重现所证明的(Escheuf等人,2019年)。 该突变使 r p h r p h rphr p h 的终止密码子移动经过pyrE之前的衰减环,从而减轻对 pyrE pyrE pyrE\operatorname{pyrE} 的转录抑制,这是由 r p h r p h rphr p h 基因中的点缺失引起的(詹森1993; Turnbough和Switzer 2008)。

这种转录水平控制在ppsA突变体中也是相关的,其中证明了 p p s A p p s A ppsAp p s A 中的突变通过基因表达的上调而不是酶动力学在乳酸盐存在下赋予选择性优势(Conrad等人,2009年; Fong等人,2005年)。由于产异生碳底物乳酸的流入指向磷酸烯醇丙酮酸-磷酸烯醇丙酮酸节点,因此推测 p p s A p p s A ppsAp p s A 的上调在异生过程中是有利的。ppsA( 72 T > G 72 T > G 72T > G72 \mathrm{~T}>\mathrm{G} )中的点突变出现在乳酸ALE的中间,随后是调节基因 h f q ( 142 A > T ) h f q ( 142 A > T ) hfq(142A > T)h f q(142 \mathrm{~A}>\mathrm{T}) 和cyaA( 2336 T > G 2336 T > G 2336T > G2336 \mathrm{~T}>\mathrm{G} )中的突变(图1 E)。此外,cyaA的突变衍生物对非PTS碳源(包括乳酸盐和甘油)表现出适应性优势,在平行ALE实验中具有高频率的固定,这可能是由于其在细胞内cAMP调节中的作用(Conrad et al.,2009年; Herring等人,2006; Peabody等人,2017年)的报告。

另一方面,已显示 h f q h f q hfqh f q 突变体在各种次优营养限制培养条件下赋予生长优势(Conrad等人,2009年; Maharjan等人,2013; Wang等人,2010),主要是通过上调转运蛋白表达来增加限制性碳底物的转运(Maharjan et al.,2013年)。最后,在第600代中观察到 y d c I ( 5 A > C ) y d c I ( 5 A > C ) ydcI(5A > C)y d c I(5 \mathrm{~A}>\mathrm{C}) 突变体(图1 E)。先前的研究表明YdcI参与细胞持久性(Hingley-Wilson等人,2020),pH稳态和醋酸盐
A



D CDS nt . change aa. change nt .  change   aa.   change  {:[nt.],[" change "]:}{:[" aa. "],[" change "]:}\begin{gathered}\mathrm{nt.} \\ \text { change }\end{gathered} \begin{gathered}\text { aa. } \\ \text { change }\end{gathered}
glpK 694G>T G232C
rpoC  小行星3610  V1204fs。
ppsA 13G>T G5R  乳酸
 拉克茨尔 686-7insG  G229fs。
rph 619del69  E207fs。 0100
hdfR 463G>T E155*  频段(%)
glpK 694G>T G232C rpoC 3610del9 V1204fs. ppsA 13G>T G5R lactate ydcl 686-7insG G229fs. rph 619del69 E207fs. 0100 hdfR 463G>T E155* Freq. (%)| glpK | 694G>T | G232C | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | :---: | | rpoC | 3610del9 | V1204fs. | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ppsA | 13G>T | G5R | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | lactate | | ydcl | 686-7insG | G229fs. | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | rph | 619del69 | E207fs. | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 0100 | | hdfR | 463G>T | E155* | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Freq. (%) |
E
F
G

Fig. 1. - E.大肠杆菌中的M9甘油和M9乳酸盐。(A)概述了GL-LA和LA-GL进化群体的适应度轨迹,该适应度轨迹由每代代数作为累积代数的函数表示。在过渡到ALE的第二阶段之前,允许ALE的第一阶段中的群体(M9甘油中的菌株GL和M9乳酸盐中的菌株LA)达到适应性平台。M9甘油和M9乳酸盐中进化菌株的适应性评估。误差条表示生物学一式三份之间的标准偏差。(B)MG 1655野生型和进化菌株之间的比生长率(SGR)比较。© MG 1655野生型和进化菌株之间的碳吸收速率(CUR)的比较。(D-E)GL-LA和LA-GL进化群体中的突变分析。ALE过程中(D)GL-LA和(E)LA-GL谱系中拟定因果突变的轨迹。 (F-G)适应性实验室进化过程中确定的致病突变的适应性评估。在各自的进化培养基中,对于衍生自(F)GL-LA和(G)LA-GL的单个和连续突变体中的每一个,将对终点菌株适合度的贡献百分比计算为每一个突变体相对于终点菌株的SGR。“na”表示具有小于 20 % 20 % -20%-20 \% 的适应度贡献的菌株。'fs'表示移码突变。( ( ) ( {:^(())\left.{ }^{( }\right) 表示P值小于 0.05 , ( ) 0.05 , ( ) 0.05,(****)0.05,(* *) 表示P值小于或等于0.01,以及( ******* * * )表示P值小于或等于0.001。样本之间统计学显著性的完整配对比较见表S3。误差条表示生物学一式三份之间的标准偏差。


代谢(Gao等人,2018年)。然而,在多个ALE实验中 y d c I y d c I ydcIy d c I 突变体复发背后的生物学仍不清楚。

GL中发现的致病突变包括rpoC(RNA聚合酶亚基)和glpK(甘油激酶)(图1D)。每个突变体出现在ALE的早期阶段。已显示rpoC中的缺失突变诱导全局代谢重新布线,其将细胞资源重新引导到生物质形成中,同时减少非必需代谢途径中的浪费性溢出(Cheng et al.,2014年)。相比之下,glpK中的突变通常使对GlpK的变构抑制失效(Applebee et al.,2011),其触发甘油的过量摄取,这可能导致碳溢出(Basan等人,2015年; Cheng等人,2014年)。rpoC和 g l p K g l p K glpKg l p K 突变体是正上位的,并且协同作用以改善菌株对甘油的适应性,其中双重突变体可以代表终点菌株中接近100%的适应性增益(Herring等人,2006年)。 两者合计,适应性变化的应变LA和GL是类似的,以前记录的,适应性进化的结果在类似的选择压力下的再现性。


2.3.适应性进化第二阶段的突变谱


接下来,我们检查了ALE第二阶段(LA-GL和GL-LA的终点谱系)中的突变谱。出乎意料的是,我们观察到在甘油上的ALE的第二阶段中 p p s A ( 72 T > G ) p p s A ( 72 T > G ) ppsA(72T > G)p p s A(72 \mathrm{~T}>\mathrm{G}) y d c I ( 5 A > y d c I ( 5 A > ydcI(5A >y d c I(5 \mathrm{~A}> C)的等位基因频率快速下降(图1D和E)。这是因为在乳酸盐进化结束时,两种突变都没有完全达到固定频率。快速清除还表明,在甘油条件下,两种突变体的适应性可以忽略不计,这得到了对复溶突变体进行的适应性试验的支持(图1F和G)。

LA-GL和GL-LA的突变谱再现了最初在LA和GL中发现的一些关键突变(图1D和E)。鉴于这两个碳共享相当一部分的产甘油途径,在乳酸进化过程中获得的突变可能在甘油限制条件下有益,反之亦然。事实上,在代谢相似的碳基质混合物上的适应性进化倾向于产生对所有碳源具有生长优势的单一通才,而那些不相似的碳基质则产生专家亚群(Sandberg et al.,2019年)。为了解决这个问题,我们进行了适应性分析的重建突变与乳酸和甘油生长条件下的单突变和多突变。


2.4.适应性突变的适应度贡献


在野生型菌株中引入LA-GL和GL-LA中的单个和多个突变,以评估每种突变在乳酸盐和甘油生长条件下的贡献。分别从LA-GL和GL-LA中鉴定的突变构建了11个和7个突变体,以其获得的时间顺序(图1F和G)。由于工程化必需基因的技术困难,rpoC突变体被排除在外。

在两种生长条件下测量每个突变体的比生长速率,以计算在终点谱系中适合度的贡献百分比。通过这种方式,我们量化了每个突变体的适应度贡献。此外,两种培养条件的适应性比较可以帮助推断突变体的性质,无论是作为一个多面手表现出对甘油和乳酸的适应性优势,或作为一个专业的突变体,在特定的条件下的行为方式。例如,众所周知的“甘油专家”突变体衍生物 g l p K g l p K glpKg l p K 694 G > T 694 G > T 694G > T694 \mathrm{G}>\mathrm{T} )和glpK(189 A > C)特别对甘油造成最大的适应性增加,对乳酸的影响可忽略不计(图1F和G)。另一方面,rph-pyrE(del)是对乳酸最适合的单一突变体,并且是对甘油的第二大适合性贡献者,突出了rph-pyrE(del)突变体的通才性质,如先前报道的(Kang等人,2019年)。

类似地,从两种培养物下的平行适合度贡献判断, h f q ( 142 A > T h f q ( 142 A > T hfq(142A > Th f q(142 \mathrm{~A}>\mathrm{T} )也显示出通才样表型


条件(图1F和G)。最后,连续突变体的适应性评估,其目的是概括的时间顺序突变收购的GL-LA和LA-GL谱系,揭示了洞察突变之间的潜在相互作用。以GL-LA谱系为例,虽然 p p s A ( 13 G > T ) p p s A ( 13 G > T ) ppsA(13G > T)p p s A(13 \mathrm{G}>\mathrm{T}) 单独缺乏对甘油的适应性没有贡献,但 g l p K ( 694 G > T ) g l p K ( 694 G > T ) glpK(694G > T)g l p K(694 \mathrm{G}>\mathrm{T}) p p s A p p s A ppsAp p s A ( 13 G > T ) ( 13 G > T ) (13G > T)(13 \mathrm{G}>\mathrm{T}) 双突变体的适应性贡献比 g l p K g l p K glpKg l p K 单独单一突变体的适应性贡献高 15 % 15 % 15%15 \% (图1F)。这表明在甘油中两种突变体之间存在协同相互作用,这是出乎意料的,因为ppsA突变体的出现仅限于乳酸盐生长条件(Conrad等人,2009年; Herring等人,2006; Kang等人,2019; Kim等人,2022; Peabody等人,2017年)的报告。类似地,与三突变体相比,包含所有四个单突变体的组合突变体显示出适应性贡献的急剧增加(图1B)。 1F),强烈暗示存在由第四突变体rph-pyrE(del)赋予的协同相互作用。相反,在获得 h f q h f q hfqh f q (142 A > T)后,在连续突变体中观察到适合度贡献的降低(图1G),表明拮抗相互作用。这种拮抗作用归因于hfq突变体的生长依赖性,它对生长缓慢的细胞有利,但限制了生长快速的细胞群的生长(Maharjan等人,2013年)。尽管组合突变形式存在明显的适应性缺陷,但hfq突变体的选择基础仍然难以捉摸。类似地,cyaA( 2236 T > G 2236 T > G 2236T > G2236 \mathrm{~T}>\mathrm{G} )单突变体对乳酸的适应性显著降低,考虑到cyaA( 2236 T > G 2236 T > G 2236T > G2236 \mathrm{~T}>\mathrm{G} )对甘油利用的有益作用,这是出乎意料的。另一个未预料到的观察结果是 y d c I y d c I ydcIy d c I 突变衍生物 y d c I ( 5 A > C y d c I ( 5 A > C ydcI(5A > Cy d c I(5 \mathrm{~A}>\mathrm{C} y d c I y d c I ydcIy d c I (686-7insG)的适合度贡献可忽略不计,与培养条件和遗传背景无关。 需要进一步研究 y d c I y d c I ydcIy d c I 突变体在菌株适应性中的作用,以解释 y d c I y d c I ydcIy d c I 突变体在独立ALE实验中的高重现性。


2.5.甘油和乳酸盐的共同利用


接下来,我们评估了甘油和乳酸盐存在下的菌株性能。如预期的,在非PTS碳源的混合物上生长的菌株中未观察到二次生长模式(图2A)。与单碳环境中的观察结果一致,适应性进化的菌株与野生型相比保持了适应性优势,其中GL和LA-GL的生长速率的倍数变化分别在1.38和2.15倍之间(图2B)。值得注意的是,系列ALE菌株在混合碳条件下表现出明显的适应性优势,如与其单一碳适应祖先相比其上级SGR所例示的(图2B;表S3)。SGR的增加伴随着CURs的一致变化,尽管菌株之间对碳底物的明显“偏好”不同(图2C;表S3)。 例如,虽然LA-GL和GL-LA中的CURs通常高于其祖先LA和GL,但LA-GL中的乳酸摄取速率低于适应前祖先中的乳酸摄取速率(图2C)。我们推测,在混合碳条件下LA-GL中乳酸摄取速率的这种降低是由于在连续ALE的第二阶段期间 ppsA ( 72 T > G ) ppsA ( 72 T > G ) ppsA(72T > G)\operatorname{ppsA}(72 \mathrm{~T}>\mathrm{G}) 突变体的损失(图1 E)。GL-LA中甘油和乳酸的CURs均高于祖先GL中的CURs(图2C)。乳酸摄取率的增加尤其显著,约为2.5倍(表S3)。推测在ALE的第二阶段期间ppsA(13 G> T)和rph-pyrE(del)的获得有助于CUR的适应性变化(图1D)。总之,在混合碳条件下在LA-GL和GL-LA中观察到的上级适应性表明适应性目标可以通过在多个目标碳上的连续进化来优化。

为了深入了解混合碳环境中适应性改善的遗传基础,我们测量了混合碳条件下每个突变体的适应性。有趣的是, g l p K ( 189 A > C g l p K ( 189 A > C glpK(189A > Cg l p K(189 \mathrm{~A}>\mathrm{C} 和694G > T > T > T>\mathrm{T} )和 p p s A p p s A ppsAp p s A 72 T > G 72 T > G 72T > G72 \mathrm{~T}>\mathrm{G} 和13G > > >> T)突变体的适合度贡献(它们中的每一个代表甘油和乳酸盐专门突变)保持与亲本野生型几乎相似


图2. - 混合碳条件下的菌株生长表型。


(A)终点菌株在含甘油和乳酸盐的混合碳基本培养基中的生长曲线。野生型和进化菌株之间的(B)比生长速率(SGR)和比碳吸收速率(CUR)的比较。(**)表示P值小于或等于0.01。误差线代表生物学三份重复样品的标准差。(D)GL-LA和(E)LA-GL在混合碳条件下获得的单个和连续突变体的适合度贡献。注意 g l p K g l p K glpKg l p K p p s A p p s A ppsAp p s A 变体中的适应性效应减弱。( F F FF )在 g l p K g l p K glpKg l p K p p s A p p s A ppsAp p s A 变体背景中引入 r p h p y r E r p h p y r E rph-pyrEr p h-p y r E (del)突变似乎赋予正上位相互作用以拯救和加强混合碳条件下相应突变体的适应性效应。


应变(图2D)。这是出乎意料的,特别是对于 g l p K g l p K glpKg l p K 突变体,其占多达 40 % 40 % 40%40 \% 的GL对甘油的适应性改善(图1)。相反,一个值得注意的适应性贡献来自多面手突变体rph-pyrE(del)以及具有 g l p K ( 694 G > ) g l p K ( 694 G > ) glpK(694 G > )g l p K(694 G>) )、ppsA(13 G> T)、pepcI(686-7insG)和rph-pyrE(del)的四重突变体。特别地,与rph-pyrE(del)单突变体和 g l p K ( 694 G > T ) p p s A g l p K ( 694 G > T ) p p s A glpK(694G > T)-ppsAg l p K(694 \mathrm{G}>\mathrm{T})-p p s A (13 G> T)-pyrcI(686-7insG)三突变体相比,四重突变体适合度分别增加了近47%和75%(图2D)。rph-pyrE(del)介导的适合度恢复在LAGL基因型中也是相关的(图2 E),强烈暗示rph-pyrE(del)通过在现有的专门突变之间施加正上位相互作用而在混合碳条件中起关键作用。

这促使我们测试在 g l p K g l p K glpKg l p K p p s A p p s A ppsAp p s A 单突变体背景中掺入rph-pyrE(del)是否会导致在混合碳条件下菌株适应性的协同增加。为此,我们构建了 g l p K ( 694 G > T ) r p h p y r E g l p K ( 694 G > T ) r p h p y r E glpK(694G > T)-rph-pyrEg l p K(694 \mathrm{G}>\mathrm{T})-r p h-p y r E (del)和ppsA(13 G> T)-rph-pyrE(del)的双突变体对。令我们惊讶的是, g l p K g l p K glpKg l p K 和rph-pyrE(del)双突变体的适合度贡献是rph-pyrE(del)单突变体的两倍,并且在ppsA-rph-pyrE(del)双突变体中增加了至少 8 % 8 % 8%8 \% (图2F)。这有力地支持了rph-pyrE(del)不仅用于拯救,而且还


增强了混合碳条件下专业突变体的适应性效应。鉴于不同的代谢途径在不同碳源的存在下是活跃的(Pan等人,2021; Sandberg等人,2017),对混合碳源的全局调节的高转录需求可能会对嘧啶生物合成受损的菌株的适应性造成瓶颈。然而,专家突变体的无效效应和rph-pyrE(del)在混合碳条件下赋予的上位效应的确切机制仍然难以捉摸。


2.6.转录组适应对连续适应性进化的响应


接下来,使用全转录组测序(RNA-Seq)来分析进化群体在各自的进化介质以及混合碳条件下的全局转录组状态的变化。主成分分析(PCA)聚类以条件特异性方式揭示了个体菌株的最佳基因表达状态(Sandberg et al.,2017年)的报告。共享共同进化历史的菌株聚集在“转录组最优性”的类似区域中(图3A)。有趣的是,我们在转录组水平上观察到进化轨迹的明显分歧


图三. - 单碳和混合碳培养条件下的转录组分析。(A)野生型和进化菌株的转录组测序读数的主成分分析。注意每个数据集的菌株和条件特异性聚类。PC表示主成分。(B)相对于甘油或乳酸限制培养条件,混合碳条件下DEG的层次聚类(方法:欧几里德,完全)。我们确定了三个集群与单方面上调的基因在混合碳条件相比,乳酸(集群1),甘油(集群2),和两者(集群3)。© GlpR、LldR、Zur和Crp-2 i模块活性的碳特异性变化。(D)GlpR-Zur和LldR-CRP-2 iModulon活性的散点图。通过相关培养条件对系列ALE样品进行染色。


尽管在适应性和因果突变方面存在明显的对等性,但它们以谱系特异性的方式存在(图1)。

基因读数计数的分层聚类也支持GL-LA和LA-GL采用的不同转录策略(补充图S2 A)。总之,这些结果表明,转录组状态的连续不断发展的细胞是偶然的转录组状态的祖先菌株和串行适应制度显示顺序依赖性在分子水平上,尽管明显收敛的终点应变健身。此外,主成分的百分比方差表明,转录组状态在ALE的第一阶段(野生型和GL之间,或野生型和LA之间)比在第二阶段(GL之间)更广泛地重新连接。


和GL-LA或LA和LA-GL;图3A)。证实了这一观察结果,相对于第一阶段,在ALE的第二阶段中差异表达基因(DEG)的数量也显著较低,表明进化的进展(补充图10)。S2 B和C)(Kavvas等人,2022年)。这一系列证据进一步突出了两个阶段之间转录组重新布线的幅度差异。


2.7.转录组的变化反映了代谢效率的提高


有证据表明进化谱系中替代碳代谢的重新布线,我们继续分析核心代谢途径,从碳吸收到能量


代谢(补充图S3)。首先,DEG分析显示进化菌株之间的基因表达存在条件特异性差异,这在与碳吸收相关的基因中最为明显。值得注意的是,与野生型菌株相比,分别编码L-乳酸通透酶和L-乳酸脱氢酶的lldP和lldD在M9乳酸盐中的所有乳酸盐进化菌株中显著上调,如先前报道的(Hua et al.,2007年)。同样值得注意的是,在M9甘油中glpK(GL、LA-GL和GL-LA)中携带错义突变的菌株中, g l p K g l p K glpKg l p K 显著下调。这是由于细胞中增强的甘油摄取导致细胞内甘油3-磷酸浓度升高,这又抑制腺苷酸环化酶(补充图S4 A)(Eppler等人,2002年)。细胞内cAMP水平的下降导致glpFKX操纵子的抑制(Applebee等,2011; Cheng等人,2014年; Kim等人,2022年)。 正如所预期的,细胞内cAMP水平的定量显示,与野生型相比,携带突变体 g l p K g l p K glpKg l p K 衍生物的菌株的细胞内cAMP浓度降低高达 38 % 38 % 38%38 \% (补充图S4B)。

第二,在不同培养条件下在所有进化菌株中普遍上调的基因涉及糖酵解和产脂途径,这是ALE菌株中反映细胞对升高的碳吸收速率的反应的会聚特征(补充图S3)(Kavvas等人,2022年)。此外,与生物量产生和能量产生相关的基因也被上调。这反映了在营养限制下适应性进化的细菌菌株中满足对生物质和能量生产的增加的需求的一般转录组响应(Choe等人,2019; Kim等人,2022; LaCroix等人,2015; Seong等人,2020年)。另一方面,在TCA循环、电子转移细胞色素和氧化还原酶中观察到基因表达的谱系特异性差异(补充图S3),这似乎导致了GL-LA和LA-GL谱系之间观察到的转录组谱差异(图3A)。

我们推断,核心代谢途径的上调反映了进化菌株中代谢效率的提高。在这种情况下,我们进一步研究了菌株在糖酵解或产气性质的烃类范围内的适应性。正如预期的那样,与野生型相比,进化菌株在单一碳源阵列上的比呼吸速率(SRR)通常更高,其中SRR增加的碳数至少是SRR降低的碳数的两倍(补充图S5)。总体而言,在至少一种进化菌株中SRR显著增加的82个碳中,我们鉴定了36个碳在进化菌株中SRR一致增加。这些包括糖酵解的中间体,如D-葡萄糖6-磷酸和D-果糖6-磷酸,各种单糖和寡糖,以及天然的碳和氨基酸(补充表S4)。

为了测试SRR的变化是否转化为生长速率的改善,我们在各种常规碳源中对野生型和进化菌株进行了生长谱分析,所述常规碳源包括M9基本培养基中的乙酸盐( 0.2 % v / v 0.2 % v / v 0.2%v//v0.2 \% \mathrm{v} / \mathrm{v} )、D-木糖( 0.2 % w / v 0.2 % w / v 0.2%w//v0.2 \% \mathrm{w} / \mathrm{v} )和D-葡萄糖( 0.2 % w / v 0.2 % w / v 0.2%w//v0.2 \% \mathrm{w} / \mathrm{v} )。此外,在富集培养基- Luria Bertani(LB)和Terrific肉汤(TB)中进行生长分析。正如预期的那样,与野生型及其祖先菌株LA或GL相比,连续进化的菌株LA-GL和GL-LA显示出更快的生长速率(补充图S6)。鉴于E.在大肠杆菌中,对两种碳源的代谢的优化也可能转化为利用相似代谢途径的碳源的代谢效率的提高。 然而,与野生型相比,进化的菌株在富集培养基中表现出适应性缺陷,这与在基本培养基中进化的菌株中报道的适应性权衡一致(Conrad等人,2010年)。串联ALE扩大了E.大肠杆菌对其他非适应性的,传统利用的碳源,在富营养化的培养条件下的健身赤字的代价。


2.8.对混合碳条件的转录组学响应


接下来,我们探讨了在混合碳生长条件下,细胞是否采用特定的转录组策略来实现最佳生长。为此,我们比较了单碳和混合碳条件之间的基因表达谱,在10个不同的数据集中获得了1205个DEG(图3B)。

基于其倍数变化值的DEG的层次聚类揭示了其表达模式中的三个不同的组。首先,甘油和混合碳条件之间的DEG显示乳酸代谢基因 l l d P , l l d R l l d P , l l d R lldP,lldRl l d P, l l d R l d d l d d lddl d d 的显著上调(簇1,图3B)。如前所述,这三个基因分别编码内膜通透酶、调节蛋白和乳酸特异性脱氢酶,它们的上调与大肠杆菌中更大的乳酸内流相关。大肠杆菌(Hua等人,2007年)。类似地,乳酸盐和混合碳条件之间的DEG揭示甘油代谢基因的显著增加,包括呼吸 g l p K D g l p K D glpKDg l p K D g p A B C g p A B C gpABCg p A B C 途径以及发酵gldA/dhaKLM途径(簇2,图3B)(Booth 2005; Gonzalez等人,2008年)。 其中,表达倍数变化值在簇内以及所有DEG中的代表性甘油同化基因 g l p K g l p K glpKg l p K g l p D g l p D glpDg l p D 中最高,进一步强调了 g l p K g l p K glpKg l p K g l p D g l p D glpDg l p D 在甘油利用中的关键作用。最后一个簇的特征在于其成员在所有菌株中普遍上调,其中大多数与翻译和蛋白质生物合成功能相关(簇3,图3B)。虽然翻译机制的活性(包括转录组变化)的增加受菌株生长控制(Cummings等人,一九九一年; Forchhammer和Lindahl 1971),混合碳条件下的比生长速率与单一碳条件下的比生长速率相比并不特别高,LA-GL和GL-LA除外。然而,混合碳条件下的菌株显示出比乳酸盐或甘油中的菌株更高的最大细胞密度(图2A和补充图2B)。 S1),这与簇3中的抑制相关基因的上调一致(图3B)。据推测,在混合碳条件下的最大细胞密度的增加归因于代谢网络的拓扑结构。将输入通量有效地分配到代谢上相邻的前体库中允许更有效地合成转化为改善的生长能力的各种结构单元(Wang等人,2019年)。总之,我们确定了一个单边转录组反应的混合碳条件下,其特征在于同时上调的一个子集的基因特异性甘油和乳酸条件下,无论进化史。


2.9.控制ALE和条件特异性转录组适应的关键调节因子


为了更深入地探索系列ALE菌株中的适应性和条件特异性转录组反应,我们对我们的数据集进行了独立成分分析(伊卡),沿着PRECISE中278个表达数据的概要(Sastry等人,2019年)。伊卡产生由特定转录调节因子独立调节的基因组。基因的表达作为每个条件的函数进行定量加权,具有特定阈值以确定基因是否是iModulon中独立调制信号的一部分。因此,在一系列遗传(ALE)和环境改变之后基因表达或调节剂活性的显著变化可以在iModulon活性中显现(Kavvas et al.,2022年)。

首先,伊卡揭示了在除了野生型之外的所有中RpoS和GadW i模块中的活性的单侧降低(补充图10)。S7 A和B)。这两种i模量的这种变化已经显示与菌株生长速率的适应性增加相关,特别是在适应性进化的菌株中(Kavvas等人,2022年)。其次,在甘油、乳酸盐或两者存在下的条件特异性转录组响应反映在GlpR和LldR i模块中(图3C)。GlpR是甘油代谢相关基因的转录调节因子,其表达依赖于甘油摄入


并导致cAMP-CRP细胞内浓度的变化(Eppler等,2002年)。类似地,LldR是控制大肠杆菌中L-乳酸代谢的转录因子。大肠杆菌(Aguilera等人,2008年)。如所预期的,GlpR iModulon的活性变化对甘油和混合培养条件是特异性的,并且LldR iModulon在乳酸盐存在下是特异性的。有趣的是,这种条件特异性iModulon活性在Zur和Crp-2 iModulon中也很明显。富含与锌离子转运和代谢相关的基因(包括znuABC和zinT)的Zur iModulon在甘油存在下显示出强活性(图3C和D以及补充图S7 C)。有趣的是,其激活的幅度密切反映了各个菌株的比甘油摄取速率,这似乎反映了锌离子在促进GlpK和变构阻遏物EIIA Glc Glc  ^("Glc "){ }^{\text {Glc }} 之间的相互作用中的协同作用(Feese等人,1994年)。 然而,考虑到EIIA Glc Glc  ^("Glc "){ }^{\text {Glc }} 对GlpK具有抑制作用,Zur活性和甘油摄取速率之间正相关的生物学意义值得进一步研究。类似地,在乳酸盐中的所有菌株中普遍激活了Crp-2 i Modulon,但在经历ALE的菌株中通常更大(图3B)。Crp-2 i模块富含磷酸转移酶系统(PTS;补充图S7 D),其活化可指示较高的PTS活性和ATP浓度的增加(Rychel等人,2022年)。为了支持这一观点,在所有三种培养条件下,与野生型相比,适应性进化菌株中与ATP生物合成途径相关的基因显著上调(补充图S3)。总之,在ALE过程中,关键调节因子的激活保持保守,但激活的幅度可能会响应于重新连接的细胞生理学(即, 碳摄取和细胞内ATP可用性)。


2.10.连续ALE提高了E.杆菌


最后,我们评估了在连续进化的菌株中重新连接的细胞生理学是否会转化为提高的生物生产能力。为此,我们针对乙偶姻,一种工业上有竞争力的


具有多种工业应用的生物化学(Cui等人,2022年)。乙偶姻生物合成途径包括乙酰乳酸合酶(AlsS)和乙酰乳酸脱羧酶(AlsD),其中两种酶虹吸出2摩尔丙酮酸以形成单个乙偶姻分子(图4A、B)。

我们使用GL-LA谱系作为评估乙偶姻生物生产能力的代表,该谱系保留了M9甘油和乳酸盐环境中的核心突变(图1D)。然而,携带乙偶姻生产质粒的菌株显示出显著延迟的滞后期和低细胞密度,表明质粒编码的代谢负荷(Silva et al.,2012年)。用于乙偶姻生产的培养基是LB肉汤(Li等人,2010;尼尔森等人,2010年; Tong等人,2016)或补充有外源氨基酸的确定成分培养基(Nakashima等人,2014; Novak等人,2020; Shen等人,2012年)。为了允许细胞利用甘油或乳酸作为唯一的碳底物,我们在生产培养基中补充酪蛋白氨基酸作为外源氮源(参见方法)。

在24 h分批培养实验中,GL-LA的乙偶姻比生产率在所有培养条件下均高于野生型和GL。(Fig. 4C和补充图S8)。在甘油中观察到乙偶姻生产率的最显著变化,其中与野生型相比,GL-LA和GL分别显示比乙偶姻生产率增加约3.7倍和2.9倍(图4C)。值得注意的是,与GL相比,GL-LA还显示出统计学上显著的1.3倍的生产率提高(图4C),突出了对第二碳源的延长进化进一步优化了其代谢效率。事实上,与野生型和单一ALE菌株相比,GL-LA中的比甘油摄取速率显著更高(补充图10)。S8 A和B)。在乳酸中,生产率的显著变化仅在GLLA中是明显的,在GLLA中,它表现出1.6和1。4-乙偶姻生产率分别比野生型和GL高一倍。GL和野生型之间的差异仍然不显着(图4C),这似乎也源于特定乳酸盐吸收率的菌株特异性差异(补充图)。S8 C和D)。 最后,在两种碳源(“混合”)的存在下,GL-LA表现出上级


见图4。- GL-LA谱系进化菌株的生物生产能力评估。(A)alsS和alsD的附加型表达系统。(B)使用甘油和乳酸盐作为碳源参与乙偶姻生产的代谢途径的简化图示。缩略语-甘氨酸:甘油,glyc 3 p:甘油3-磷酸,dhap:甘油酮磷酸,g3 p:甘油醛3-磷酸,1, 3dpg:1,3-二磷酸-D-甘油酸,3 pg:3-磷酸甘油酸,2 pg:2-磷酸甘油酸,pep:磷酸烯醇丙酮酸,pyr:丙酮酸,q8 h2:泛醌-8,q8:泛醌-8,lac_L:L-乳酸,alac:乙酰乳酸,actn:乙偶姻,后缀_c:细胞质,后缀_e:细胞质外。©最大乙偶姻比生产率的比较。(*)P值小于0.05,( ***** * )小于或等于0.01,( ******* * * )小于或等于0.001,(ns)不显著。误差条表示三个生物学重复中的标准偏差。


与在单碳环境中的结果一致的是,三羟乙偶姻生产率高于其余部分(图4C)。有趣的是,当乳酸盐而不是甘油的消耗速率最快时,观察到最高的比乙偶姻生产率(补充图1A和1B)。S8E和F)。据推测,这种观察归因于输入碳底物和目标代谢物之间的代谢距离的差异(Washina等人,2016),其中乳酸盐到乙偶姻的四步生物转化可以产生更少的代谢成本,因此与甘油相比更有效(图4B)。总之,这一系列证据强调,具有对多种碳源的连续适应历史的菌株在菌株适应性和目标代谢物产生方面对每种单一和混合进化碳底物表现出优越的上级性能。 这证明了连续ALE方法用于利用具有在多碳环境中进行生物生产的期望能力的生产菌株的潜在效用。

 3.讨论


在我们以前的工作中,我们广泛地描述了E.大肠杆菌在甘油和L-乳酸作为唯一的碳底物中进化,重点是生长表型(Fong等人,2005),适应的遗传基础(Conrad et al.,2009年; Herring等人,2006),以及转录和代谢网络(Cheng et al.,2014年; Conrad等人,2010; Utrilla等人,2016年)。在这项研究中,我们评估了E。大肠杆菌在二碳底物甘油和乳酸中进行连续适应。

值得注意的是,无论进化顺序如何,在两种进化培养条件下,终点菌株都显示出“通才表型”,这一点可以从大量的适应性增益中看出。此外,与野生型和单碳适应菌株相比,它们在混合碳条件下的表现同样更好。虽然这展示了连续ALE在利用代谢多功能微生物方面的适用性,但先前的一项研究表明,适应的结果在很大程度上取决于目标碳源之间的代谢相似性。对含有“代谢相似”碳基质的碳混合物的适应性进化倾向于产生在进化碳基质上茁壮成长的单一通才群体(Sandberg等人,2017年)。然而,具有一定程度的代谢相异性的碳混合物可以产生专家亚群,每个亚群依靠优选的碳或代谢产物生存(Sandberg等人,2017年)的报告。 我们的方法与以前的多碳ALE实验不同,因为种群被允许一次适应单一碳源。这将允许规避碳专业化中的适应性权衡(Saxer等人,2010)或由于优先使用碳而导致的下注对冲行为(Solopova等人,2014年)。因此,预期连续ALE将使单个占主导地位的通才进化成为可能,而不是共存的亚群。

突变谱的不断发展的人口揭示了高度的进化收敛,所示的因果遗传突变体的存在,有助于显着的适应性适应性观察到的终点菌株。在连续进化的种群中,适应性的关键贡献者是 g l p K , p p s A g l p K , p p s A glpK,ppsAg l p K, p p s A r p h p y r E r p h p y r E rph-pyrEr p h-p y r E 的变体,这与先前关于甘油和乳酸盐限制环境的ALE实验一致(Cheng等人,2014年; Conrad等人,2009年; Herring等人,2006; Kang等人,2019年; Kim等人,2022; Peabody等人,2017年; Scheuf等人,2019年)。如先前所报道的,单个和顺序工程化突变体的特定菌株适应性在很大程度上类似于其他变体。然而,有趣的是,包括 g p K g p K gpKg p K p p s A p p s A ppsAp p s A 变体在内的“专业突变体”的适应性效应在混合碳条件下减弱,但在引入rph-pyrE突变体后得到了挽救。 虽然这种条件特异性上位性相互作用的机制基础尚不清楚,但 r p h p y r E r p h p y r E rph-pyrEr p h-p y r E 突变体在缓解大肠杆菌中停滞的嘧啶生物合成中的功能属性仍不清楚。大肠杆菌(詹森1993; Turnbough和Switzer 2008)似乎暗示核苷酸生物合成和转录的参与是混合碳条件下生长的潜在瓶颈。

在进化和混合碳条件下的野生型和进化菌株的转录组图谱显示,尽管在适应性和突变图谱中存在明显的奇偶性,但在转录组水平上以lineagspecific方式在进化轨迹上存在显著的分歧。然而,基因表达变化的总体趋势,例如由于减弱的选择压力而导致的ALE第二阶段中DEG计数的减少(补充图10)。S2 B和C)(Conrad等人,2010),以及生物质和能量产生途径的典型上调(Choe et al.,2019; Kim等人,2022; LaCroix等人,2015; Seong等人,2020),在两个谱系中保持保守。伊卡分析还揭示了在进化菌株中“ALE特异性”调节器(RpoS和GadW)以及“条件特异性”调节器(GlpR、LldR、Zur和Crp-2)的单侧激活。 激活的幅度不同,这似乎反映了应变表型的适应性变化,如碳吸收和生长速率的基因表达的改变。

提高微生物对原料碳的代谢效率是细菌生物生产性能的核心。当使用非优先碳源(例如甘油和乳酸盐)作为原料碳底物时,这一点尤其如此(Fong等人,2003; Ibarra等人,2002年)。考虑到替代碳源在基于微生物的增值化合物生产中的新兴应用,工业相关细菌中固有的低效代谢被积极解决以简化替代碳源的更有效的生物转化(Elmore等人,2020年; Kim等人,2022; Seong等人,2020年; Song等人,2022年)。这种替代原料以混合物而不是单一底物的形式出现的事实(Elmore等人,2020),利用多种底物的能力在生物转化应用中至关重要。在此方面,系列ALE在提高E. 大肠杆菌值得注意。尽管在当前的研究中没有证明,但是预期将连续ALE方法与代谢工程和合成偶联策略一起组合使用协同增强生物生产性能的优化(Pontrelli et al.,2018年; Seong等人,2020年)。总之,这证明了系列ALE在利用在使可再生的异质原料增值方面优化的“底盘”菌株中的潜在适用性。

 4.材料和方法


4.1.菌株和生长条件


本研究中使用的菌株和质粒列于补充表S1中。E.在补充有M9盐(BD Biosciences,圣何塞,CA)、2 mM的 MgSO 4 , 0.1 mM MgSO 4 , 0.1 mM MgSO_(4),0.1mM\mathrm{MgSO}_{4}, 0.1 \mathrm{mM} CaCl 2 CaCl 2 CaCl_(2)\mathrm{CaCl}_{2} 的M9基本培养基中培养野生型大肠杆菌MG 1655。补充 0.2 % 0.2 % 0.2%0.2 \% (v/v)L-乳酸盐(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)或 0.2 % 0.2 % 0.2%0.2 \% v / v v / v v//v\mathrm{v} / \mathrm{v} )甘油(Samchun Chemical,Daejeon,South Korea)作为碳源。除非另有说明,否则本研究仅使用L-乳酸盐。除非另有说明,否则将细胞在 30 C 30 C 30^(@)C30^{\circ} \mathrm{C} 下孵育。对于比生长速率测量,将 80 C 80 C -80^(@)C-80^{\circ} \mathrm{C} 甘油细胞储备物在3 mL补充有甘油( 0.2 % v / v 0.2 % v / v 0.2%v//v0.2 \% \mathrm{v} / \mathrm{v} )L-乳酸盐( 0.2 % v / 0.2 % v / 0.2%v//0.2 \% \mathrm{v} / v)或M9混合物(甘油、L-乳酸盐,各 0.1 % v / v 0.1 % v / v 0.1%v//v0.1 \% \mathrm{v} / \mathrm{v} )的M9基本培养基中预培养,这取决于测试的碳源。将过夜培养物接种到300 mL锥形瓶中的60 mL培养基中。所有细胞培养均在有氧条件下进行。


4.2.实验室适应性进化


E E EE 的两个独立谱系。coli K-12 MG 1655的适应性进化采用两阶段适应机制,每个阶段的碳源不同。每个谱系首先从L乳酸(LA)进化到甘油(LA-GL),反之亦然(GL和GL-LA),经过1400到1600代以上。从相同的克隆群体开始,在300 mL锥形瓶中的60 mL工作体积的M9基本培养基中连续繁殖培养物。在振荡(200 rpm)下将繁殖维持在 30 C 30 C 30^(@)C30^{\circ} \mathrm{C} ,这允许连续


每天转移两次。在达到中等指数生长 ( OD 600 nm OD 600 nm (OD_(600nm):}\left(\mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}}\right. 0.4 0.6 ) 0.4 0.6 ) 0.4-0.6)0.4-0.6) 后,将培养物连续传代至新鲜培养基。传代伴随着初始光密度的技术降低,以补偿生长速率的适应性增加。使用每次连续传代的初始和最终光密度估计每次传代的倍增时间。为了将ALE、GL和LA的第一阶段中的终点菌株过渡到第二阶段,将其在“非适应性”碳源(M9 L-乳酸盐中的菌株GL和M9甘油中的LA)中孵育的过夜预培养物分别转移到M9 L-乳酸盐和M9甘油中。

 4.3.生长测定


使用Epoch 2或Synergy HT酶标仪(BioTek,Winooski,VT)在 30 C 30 C 30^(@)C30^{\circ} \mathrm{C} 下振荡(807 rpm双轨道)24 h进行重构突变体的生长速率实验,使用默认48孔配置,工作体积为 300 μ L . OD 600 nm 300 μ L . OD 600 nm 300 muL.OD_(600nm)300 \mu \mathrm{~L} . \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}} ,以 30 min 30 min 30-min30-\mathrm{min} 间隔测量。使用相同的仪器设置进行野生型和进化菌株在非适应性碳源(包括乙酸钠(Sigma-Aldrich)、D-木糖(Sigma-Aldrich)和D-葡萄糖(Sigma-Aldrich))中以及在富集的Luria Bertani肉汤(BD)和Terrific肉汤(BD)中的生长速率实验。


4.4.碳底物和代谢物的定量


使用高效液相色谱法测定底物和代谢物浓度的变化。通过 0.2 μ m 0.2 μ m 0.2 mum0.2 \mu \mathrm{~m} 孔径注射器过滤器过滤培养用过的培养基。使用具有RID-20 A RI检测器(Shimadzu,京都,日本)和MetaCarb 87 H有机酸柱(Agilent,Santa Clara,CA)的Nexera LC-40 HPLC系统分析滤液。柱用 0.007 N H 2 SO 4 0.007 N H 2 SO 4 0.007NH_(2)SO_(4)0.007 \mathrm{~N} \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} 0.6 mL / min 0.6 mL / min 0.6mL//min0.6 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} 的流速和 50 C 50 C 50^(@)C50{ }^{\circ} \mathrm{C} 的烘箱温度洗脱。当分析混合碳样品时,烘箱温度设定在 65 C 65 C 65^(@)C65^{\circ} \mathrm{C}


4.5.全基因组重新测序和数据分析


使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega,麦迪逊,WI)分离基因组DNA(gDNA),使用Qubit T M T M ^(TM){ }^{T M} dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)用Qubit® 2.0荧光计(Invitrogen,卡尔斯巴德,CA)进行质量检查和定量。使用Covaris S220聚焦超声发生器(Covaris,Woburn,MA)将gDNA样品片段化。使用TruSeq DNA PCR free试剂盒(Illumina,San Diego,CA)制备NGS文库。在Illumina HiSeq 2500系统上以快速运行模式作为50个循环的单端反应进行测序。在CLC Genomics测序仪(CLC bio,Aarhus,丹麦)上处理和分析测序数据。使用Trim Sequence Tool以0.05的质量限度修剪衔接子序列。丢弃含有两个以上模糊碱基的读段,并将剩余读段映射到参考基因组(NCBI登录号NC_000913.3),参数如下:错配成本:2,插入缺失成本:3,长度和相似性分数:0.9。 使用具有以下参数的基于质量的变体检测工具进行变体识别:邻域半径:5,最大缺口和错配计数:5,最小邻域和中心质量:30,最小覆盖度:10,最小变体频率: 10 % 10 % 10%10 \% ,以及最大预期等位基因:4。忽略非特异性匹配,使用细菌和植物质体遗传密码。


4.6.突变的反向工程


使用如前所述的一步失活方法构建携带目的突变的单个和连续突变体(Datsenko和Wanner 2000)。简而言之,突变体和野生型基因构建体从以下任一种的基因组DNA扩增:


使用适当引物的野生型或携带终点变异体的群体(补充表S2)。使用pKD 13作为模板扩增卡那霉素抗性盒。在重叠延伸PCR中使用两个PCR扩增子产生含有突变体序列和卡那霉素盒的DNA。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen,希尔登,德国)纯化扩增的DNA,并使用MicroPulser(Bio-Rad,Hercules,CA)将其引入含有pKD 46的电感受态细胞中。在含有 50 μ g / mL 50 μ g / mL 50 mug//mL50 \mu \mathrm{~g} / \mathrm{mL} 卡那霉素的LB琼脂平板上选择卡那霉素抗性受体,并使用PCR筛选基因型。用pCP 20转化PCR确认的菌落以消除卡那霉素抗性标记,然后在LB培养基中在 42 C 42 C 42^(@)C42^{\circ} \mathrm{C} 下固化。 通过将野生型mutT(8-氧代-dGTP二磷酸酶)和dam(DNA腺嘌呤甲基转移酶)引入其基因组的lacZ位点,LA和LA-GL菌株中由mutT和dam突变引起的增变子表型得以恢复。将野生型dam基因引入LA-GL中的lacZ:mutT上游。这两种具有恢复的突变性的菌株用于乙偶姻生物生产。


4.7.总RNA提取和核糖体RNA去除


在指数生长期间收集野生型和终点菌株的细胞培养物,并在冰上淬灭。使用用于革兰氏阴性细菌的RNASnap TM TM ^(TM){ }^{\mathrm{TM}} 方案从收集的细胞中提取总RNA(Stead等人,2012年)。简言之,将细胞沉淀物重悬于 100 μ L 100 μ L 100 muL100 \mu \mathrm{~L} RNASnap溶液(18 mM EDTA、0.025% SDS、 1 % β 1 % β 1%beta1 \% \beta -巯基乙醇和 95 % 95 % 95%95 \% 甲酰胺)中。将混合物在 95 C 95 C 95^(@)C95{ }^{\circ} \mathrm{C} 下孵育7分钟,并在 16 , 000 × g 16 , 000 × g 16,000 xx g16,000 \times g 下离心5分钟。按照制造商的说明书,使用RNA Clean & Concentrator-5试剂盒(Zymo,Irvine,CA)纯化上清液。使用定制的核糖体RNA消耗方法消耗核糖体RNA(rRNA)和基因组DNA污染物(Choe等人,2021年)。简而言之,定制设计的与E. coli rRNA与总RNA池中的靶rRNA转录本杂交。 添加RNase H(10 U)以特异性降解RNA:DNA双链体(与rRNA转录物杂交的抗rRNA探针),并添加12 U DNase I以去除gDNA片段和引物二聚体。


4.8.转录组测序( R N A R N A RNAR N A -seq)


根据制造商的方案,使用TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit(Illumina)用10-100 ng rRNA耗尽的RNA构建RNA-Seq文库。使用具有Qubit 2.0荧光计的Qubit dsDNA HS测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对所得RNA-seq文库进行定量,并使用配备有高灵敏度D1000筛选带(Agilent)的TapeStation 2200进行质量检查。使用HiSeq ten X平台用150个循环的双端反应对文库进行测序。

 4.9.数据处理


使用CLC Genomics Workbench(CLCBio)处理RNA测序数据。使用“NGS核心工具”下的“修剪序列工具”修剪原始读数,质量限值为0.05。丢弃具有多于两个模糊核苷酸的读数。将修剪的读段映射到E. coli MG 1655参考基因组(NC_000913.3),使用以下参数:错配成本,2 ;插入缺失成本,3 ;长度和相似性分数,0.9。R中的DESeq 2包用于标准化基因表达并确定数据集之间的倍数变化值(Love et al.,2014年)。


4.10. RNA-seq数据的i模分析


对于独立成分分析(伊卡),我们将 log 10 log 10 log_(10)\log _{10} (TPM)转化的基因表达数据整合到278个E. PRECISE中的大肠杆菌表达数据集(Sastry等人,2019年)。rna-seq数据


使用公众可获得的代码库(github.com/SBRG/precise-db),使用“control_wt_glc”作为基线对照(Sastry等人,2019年)。OptICA使用随机种子迭代100次,收敛容差为 10 7 10 7 10^(-7)10^{-7} 。我们将每次迭代中的分量数量限制为重建主分量分析计算的方差的分量数量。DBSCAN用于识别鲁棒的独立组件。如前所述提取所得iModulon(Sastry等人,2019年)。


4.11.细胞内cAMP测定


在指数生长期收获野生型和终点谱系的细胞培养物。收集的细胞数量与20 mL培养物( OD 600 nm = 1.0 OD 600 nm = 1.0 OD_(600nm)=1.0\mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}}=1.0 )的细胞数量大致相同。将细胞培养物在 4000 × g 4000 × g 4000 xx g4000 \times g 下离心10分钟。将细胞沉淀用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS; pH 7.2)洗涤,离心并重悬于cAMP ELISA比色试剂盒(Cell Biolabs,San Diego,CA)提供的裂解缓冲液中。将样品在室温下孵育20分钟。在 16 , 000 × g 16 , 000 × g 16,000 xx g16,000 \times g 下离心10分钟后,使用非乙酰化方案将细胞裂解物用于测定细胞内cAMP水平。每份样品重复测定两次。


4.12. Biolog表型微阵列


收获在 30 C , 200 rpm 30 C , 200 rpm 30^(@)C,200rpm30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} 的M9甘油和乳酸碳混合培养基中孵育的细菌的过夜培养物,用冰冷的PBS洗涤两次。将洗涤的细胞沉淀物重悬于IF-0a GN/GP悬浮液(Biolog,海沃德,CA)中,并在IF-0a GN/GP中以 OD 600 nm = 0.05 OD 600 nm = 0.05 OD_(600nm)=0.05\mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}}=0.05 的最终细胞密度稀释。将细胞悬液置于冰上,直至将 100 μ L 100 μ L 100 muL100 \mu \mathrm{~L} 转移至表型微阵列板(PM 1和PM 2A,Biolog),一式三份。使用Omnilog仪器在 30 C 30 C 30^(@)C30^{\circ} \mathrm{C} 下测量呼吸速率的变化,持续48 h。阴性对照的曲线下面积(AUC)用作辨别假阴性生长的基线。选择AUC高于阴性对照的PM威尔斯孔进行下游分析。使用样本之间的student独立 t t tt 检验计算统计学显著性。

 4.13.产生乙偶姻


E.用pTrcHis 2A-alsSD转化大肠杆菌MG 1655野生型、GL和GL-LA菌株,所述pTrcHis 2A-alsSD设计为表达枯草芽孢杆菌衍生的alsS(BsualsS)和嗜水气单胞菌衍生的alsD(AhyalsD)(Choe等,2022年)。将氨苄青霉素抗性转化体接种到60 mL M9甘油( ( 0.2 % v / v ( 0.2 % v / v (0.2%v//v(0.2 \% \mathrm{v} / \mathrm{v} 甘油)、M9乳酸盐( 0.2 v / v 0.2 v / v 0.2v//v0.2 \mathrm{v} / \mathrm{v} L-乳酸盐)、M9混合物(各 0.1 % 0.1 % 0.1%0.1 \% 甘油和乳酸盐)、0.2%酪蛋白氨基酸(BD Biosciences)和 100 μ g / mL 100 μ g / mL 100mug//mL100 ~ \mu \mathrm{~g} / \mathrm{mL} 氨苄青霉素中,在 30 C 30 C 30^(@)C30{ }^{\circ} \mathrm{C} 下振荡。在接种后2 h使用 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 异丙基 β β beta\beta -D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导alsS和alsD的表达。培养物上清液以2小时间隔取样,直到细胞密度达到平台。


CRediT作者贡献声明

Kangsan Kim: Writing - original draft, Visualization, Investigation, Formal analysis, Data curation. Donghui Choe: Writing - review & editing, Investigation, Data curation. Minjeong Kang: Investigation, Data curation. Sang-Hyeok Cho: Investigation, Data curation. Suhyung Cho: Resources, Funding acquisition. Ki Jun Jeong: Resources. Bernhard Palsson: Writing - review & editing, Methodology, Funding acquisition. Byung-Kwan Cho: Writing - review & editing, Supervision, Methodology, Funding acquisition. 重试    错误原因


竞合利益声明


没有要宣告的恩怨。

 数据可用性


数据将根据要求提供。

 确认


这项工作得到了韩国生物大挑战赛(2018 M3 A9 H3024759 to B.- K.C.),生物医学技术开发计划(2021 M3 A9 I4024308 to B.- K.C.)和C1天然气炼油项目(2018 M3 D3 A1 A01055733至B.- K.C.)通过韩国国家研究基金会(NRF),由科学和信息通信技术部资助;韩国国家研究基金会(NRF)由韩国政府(MSIT)资助(2021 R1 A2 C1012589 to S.C.);诺和诺德基金会(NNF)生物可持续性中心(NNF 16 CC 0021858 to B. P.);以及韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)研究倡议计划(KGM 5402322)。


附录A.补充数据

Supplementary data to this article can be found online at https://doi. org/10.1016/j.ymben.2024.04.004. 重试    错误原因

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    • 通讯作者。韩国科学技术高等研究院生物科学系,大田,34141,大韩民国。

    电子邮件地址:bcho@kaist.ac.kr(B.- K. Cho)。