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人体骨骼肌衰老图谱 The Aging Atlas of Human Skeletal Muscle

收稿日期: 2023-11-20 收稿日期:2023 年 11 月 20 日
录用日期: 2024-03-19 录用日期:2024 年 3 月 19 日
网络出版日期: 2024-04-15 网络出版日期:2024 年 4 月 15 日
检查更新
\author{ Veronika R. Kedlian (1) 1,9, 王亚宁 , 刘天亮 (1) 2,3,9 , 陈晓平 ,

埃琳娜·普里格莫尔(1,维塔利·克列什切夫尼科夫),扬·帕特里克·佩特(1)',李彤(1)',约翰·劳伦斯',沙尼·佩雷拉',马丁·普雷特',黄倪',秦国²,
曾新瑞
, 陆阳 (1) ', 克日什托夫·波兰斯基
,陆阳(1)',克日什托夫·波兰斯基



[D', 娜娜-简·奇潘佩 (1)',
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莫妮卡·达布罗夫斯卡', 李晓波5, 奥马尔·阿里·拜拉克塔尔 [ [ ', 米纳尔·帕特尔', 熊坂夏彦', 克里希纳·马布巴尼
, Andy Peng Xiang ((2)), Kerstin B. Meyer ( , 库罗什·赛义布-帕西 , 莎拉·泰希曼
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张洪波  张洪波
}

抽象

骨骼肌老化是导致年龄相关性虚弱和肌肉减少症的关键因素,对全球健康有重大影响。在这里,我们分析了来自17个供体的90,902个单细胞和92,259个单核,以绘制成人肋间肌肉的衰老过程,确定每个肌肉区室的细胞变化。我们发现肌肉干细胞的不同亚群表现出核糖体生物发生基因减少和 CCL2 表达增加,导致不同的衰老表型。我们的图谱还强调了与神经肌肉接头相关的细胞核的扩张,这可能反映了再神经支配,并概述了如何通过随着年龄增长而通过再生和上调慢肌纤维中快速型标记物来减轻快肌纤维的损失。此外,我们记录了衰老肌肉微环境在免疫细胞吸引中的作用。总体而言,我们提供了全面的人体骨骼肌衰老资源(https://www.muscleageingcellatlas.org/)与内部小鼠肌肉图谱一起研究跨物种肌肉老化的共同特征。

骨骼肌构成 我们的体重,对运动至关重要,在新陈代谢和免疫调节中起着关键作用 .骨骼肌的主要成分,多核肌纤维(MFs),根据其收缩速度、结构蛋白组成和代谢特征(氧化与糖酵解)分为“慢抽搐”(I型)和“快抽搐”(IIA型、IIX型和中间杂化纤维)。MF 被单核肌肉干细胞 (MuSC) 包围,这些干细胞在损伤后可以产生新的 MF。此外,肌肉微环境由支持成纤维细胞、脉管系统、免疫细胞、雪旺细胞和神经元轴突组成,它们将动作电位传递给 MF。
骨骼肌老化的特征是肌肉质量和力量的丧失,通常导致肌肉减少症 .这是导致老年人跌倒和骨折的主要因素,是造成伤害和死亡的第二大原因 .在衰老过程中,快抽搐 MF 的数量和大小都会选择性减少 .此外,MuSC的数量及其对刺激的激活和增殖随着年龄的增长而减少 .然而,目前尚不清楚这种萎缩的增加是由于基因表达的MF内在变化,细胞微环境的影响还是两者的结合。还研究了其他几种假定的肌肉衰老因素,如干细胞衰老、去神经支配、代谢失调和慢性炎症 .
以前的大多数研究都集中在一种特定的机制或细胞类型上,这给我们对肌肉衰老的整体理解留下了空白。为了解决这个问题,最近的小鼠和人类骨骼肌研究率先使用单细胞RNA测序(scRNA-seq) 或单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 了解肌肉细胞类型异质性及其在衰老中的变化。然而,这两种方法在单独应用于肌肉时都有局限性:液滴单细胞测序方法由于其体积大而无法捕获 MF,并且单核测序通常缺乏对肌肉微环境中丰度较低的 MuSC 和其他单核细胞类型的分辨率。
在本研究中,我们在整个成年人的生命周期中对肋间肌进行了关节 scRNA-seq 和 snRNA-seq。这使我们能够研究衰老过程中MuSC、MF和微环境细胞的转录变化。我们发现了可能导致衰老表型的细胞间相互作用。我们还对肋间肌进行了 MF 分型,以将关于 MF 动力学的标准组织学观察与单核数据中的转录变化联系起来。最后,通过从小鼠骨骼肌中生成年龄匹配的单细胞和单核转录组,我们研究了不同物种衰老机制的相似性。

结果

单细胞和单核骨骼肌衰老图谱 单细胞和单核骨骼肌衰老图谱 --> Single-cell and mononuclear skeletal muscle aging atlas
为了全面了解人类骨骼肌衰老,我们分析了 90,902 个细胞和 92,259 个细胞核的转录组,这些细胞来自 8 名年轻(约 20-40 岁)和 9 名老年(约 60-75 岁)供体的肋间肌肉活检使用基于液滴的 3' 测序(图 1a、b 和补充表 1)。
通过单细胞变分推理 (scVI) 22 自动编码器对单细胞和单核数据进行批量校正和积分后(参见补充说明 1 与 Harmony 的比较 ),我们注释了 40 个主要的人类骨骼肌群体,每个群体都显示经典标记基因(图 1c、扩展数据图 1a、补充表 1 和补充信息)。我们鉴定了单核 MuSC、成纤维细胞、平滑肌细胞 (SMC)、周细胞、内皮细胞、脂肪细胞、髓鞘和非髓鞘雪旺细胞、免疫细胞以及最后的多核 MF。大多数细胞类型在所有年龄组、技术和化学版本中被捕获,在技术和年龄组之间观察到重要差异(图1d,扩展数据图1b-d和方法)。MuSCs和成纤维细胞在这两种技术中都得到了很好的代表。值得注意的是,scRNA-seq对免疫细胞、脉管系统细胞和雪旺细胞亚型的分辨率更高,而snRNA-seq更能捕获肌核和脂肪细胞(图1d和扩展数据图1e-g)。这说明了将这两种技术结合起来的优势。
接下来,我们比较了年轻肌肉和老年肌肉的广泛细胞组成。来自老年供体的肌肉样本强烈富集了免疫细胞亚型,包括自然杀伤 (NK) 细胞、T 细胞、B 细胞 ( 细胞、B血浆)和肥大细胞,而血管细胞(SMC、动脉内皮细胞和毛细血管内皮细胞)和雪旺细胞(图1d,扩展数据图2a-c和方法)被耗尽。B细胞和T细胞的增加与衰老小鼠大脑,肝脏和脂肪组织的研究一致 以及最近的一份报告,强调了多种人体组织中与年龄相关的免疫浸润 .同样,随着年龄的增长和去神经支配,先前在肌肉中报道了多个器官的血管化减少 .老化的肌肉还含有更多的MF片段(表示为MF-Isc和MF-IIsc),这可能反映了老化的MF更容易降解(图1d和补充说明4)。大多数供体在住院期间接受了无创持续气道正压通气(CPAP)或机械通气(有关供体的完整元数据,请参见补充表1)。因此,我们探讨了住院时间长短(作为通气时间的“代表”)和其他生物协变量(体重指数(BMI)和性别)对细胞类型丰度变化的影响,发现它们不会影响主要的衰老趋势(补充说明2和补充图1)。
为了比较物种之间的肌肉老化过程,我们通过对5只年轻(3个月)和3只老(19个月)小鼠的后肢肌肉的68,956个细胞和27,573个细胞核进行测序,生成了小鼠肌肉衰老图谱(图1a和扩展数据图2d-g)。该图谱产生了与人类骨骼肌相同的主要细胞类型(扩展数据图2d,e和补充表1),包括MuSC,SMC,内皮细胞,成纤维细胞,脂肪细胞,雪旺细胞,免疫细胞和不同状态的肌核,这使我们能够检查不同物种的常见肌肉衰老特征(如下所述)。
总体而言,我们的scRNA-seq和snRNA-seq数据集确定了骨骼肌中随着年龄的增长而存在的主要细胞类型。我们的综合地图集可作为在线资源提供,以便于浏览和下载数据,网址为https://www.muscleageingcellatlas.org.

人类MuSC衰老的机制见解

为了获得对MuSC衰老的机理见解,我们对17,528个高质量的MuSC进行了亚聚类,并确定了构成整个MuSC簇的四个亚群(图2a),这些亚群在与其他人类肌肉类型整合后也被概括 (扩展数据图3a,b)。除了通常定义的静态 MuSC(标记为主 MuSC)和瞬态分化状态(标记为 MYOG MuSC),我们发现了另外两个鲜为人知的亚型:TNFRSF12A 和 ICAM1 )MuSCs(图2a和附表2)。值得注意的是,有可能 MuSC表示在分离过程中产生的潜在伪影 .
差异表达基因 (DEGs) 的基因本体 (GO) 富集分析 MuSC将“发育”和“核糖体生物发生”确定为最富集的类别,后者是MuSC激活和增殖所必需的 (图 2b 和补充表 2)。这表明 亚群代表参与肌肉再生的活化 MuSC,最近的一项研究也表明了这一点 . MuSCs还与小鼠激活的MuSC共享标记基因 (扩展数据图 3c)。使用不同年龄的差异细胞丰度测试 (Milo) ,我们观察到 Main 的减少, 亚群(图2c)与荧光激活细胞分选(FACS)证实的MuSCs普遍下降一致 (扩展数据 Fig. 3d,e)。
推定激活 状态在衰老过程中显示出最显着的丰度下降(图2c),表明MuSC活化下降,这是啮齿动物模型中MuSC衰老的标志之一 .这 状态在核糖体生物发生基因集表达方面也表现出最大的下降,包括核糖体组装基因和POLR1D,POLR1D是形成RNA聚合酶I组装平台的关键亚基(图2d,e和补充表2和3)。使用原代成肌细胞培养模型,我们证实与年轻人相比,老年人在转录和翻译水平上的核糖体组装基因减少(图1)。 和扩展数据图3f)。值得注意的是,老年患者的成肌细胞培养物显示出衰老的几个特征,包括细胞周期蛋白抑制剂 CDKN2A 和 TP53 的上调(图 1)。 ), -半乳糖苷酶活性(扩展数据图3g)和衰老相关分泌表型(SASP;扩展数据图3h)。尽管典型的 SASP 因子在 MuSC 中表达较低,但包括 IGFBP3、IGFBP4、IGFBP6、IGFBP7 和 在年龄上调 MuSCs(补充图3)。 一个
肋间肌 单细胞和单核解离
( 年)与( 年)
年)与( 年)
b
c
铬 10x

scRNA-seq/snRNA-seq 单细胞 RNA 测序/单核 RNA 测序
d
图1 单细胞和单核骨骼肌衰老图谱。a、实验设计和主要研究方向的视觉概述。插图是用BioRender.com.b.显示scRNA-seq/snRNA-seq(8岁年轻对9岁)和肌纤维亚型(7岁年轻对4岁)的跨年龄人类肌肉采样的时间尺度,肌肉衰老细胞图谱中注释细胞的均匀流形近似和投影(UMAP)可视化。所有群体的细胞类型注释和缩写显示在补充表10.d中。 -转换的倍数变化 ) 与细胞核分数(第二列和第三列)相比,不同年龄的细胞簇丰度和细胞富集程度(第二列和第三列) 化学(参见扩展数据图1d中的完整版本)。一些群体(杂交、特化肌核、MF-Isn 片段、MF-IIsn 片段、中性粒细胞、间皮细胞、红细胞 (RBC)、嗜酸性粒细胞和浆细胞样树突状细胞 (PDC))被从图中移除,因为它们代表了不同细胞类型的混合物,包含极少量的细胞或主要来源于特定供体。LTSR 表示统计显著性,范围从 0 到 1,其中 1 表示置信度估计值。有关详细信息,请参阅方法。ArtEC,动脉内皮细胞;CapEC,毛细血管内皮细胞; ,常规 1 型和 2 型树突状细胞;mSchwann 和 nmSchwann,髓鞘和非髓鞘雪旺细胞。
此外,MuSC亚型的FACS在年龄较大的人群中显示出CDKN2A和CDKN1A基因的特异性上调 与 ICA 相比 和主要的MuSC(图2k和扩展数据图3i)。在动物模型中,核糖体组装功能障碍可导致核糖体缺陷并导致干细胞衰老 .这些结果共同表明 MuSC比其他亚群经历更多的衰老(另见SenMayo基因集评分的补充说明3 ),与核糖体生物发生基因表达的减少一致。因此,我们认为核糖体组装减少会导致MuSC激活失败,进而可能导致人类MuSC衰老。
另一个新报告的州, MuSC表达特异性细胞因子(包括CXCL1、CXCL2、IRF1和IER3)和NF-KB调节因子TNFAIP3和NFKBIZ(图2a),表明免疫相关表型。在FACS分选的ICA中通过定量PCR(qPCR)分析进一步证实了这种免疫特征 MuSC(图21和扩展数据图3j)。尽管已知免疫细胞对 MuSC 的成功再生至关重要 ,衰老相关炎症对 MuSC 生态位的影响目前尚未解决。值得注意的是,我们发现,随着年龄的增长,促炎细胞因子基因 MuSCs(图1)。 和补充表3),通过qPCR确认(图2n)。已知 CCL2 的表达受转录因子的严格调控 ,炎症的关键介质 .事实上,使用 pySCENIC 测定转录因子活性 突出显示NF-кB复合物的组分作为MuSC中CCL2表达的推定调节因子(扩展数据图3k)。有趣的是,两种经典的NFKB1抑制剂TNFAIP3和NFKBIZ明显减少(图1)。 和补充表3),而NF-кB激活剂ІкB激酶IKK (CHUK)在FACS分型的老化ICA中显著上调 MuSCs(图2n)。因此,我们推测NF-KB复合物在老年ICA中被激活 MuSCs,导致CCL2转录增加(扩展数据图3l),这可能导致免疫稳态受损和慢性炎症。

集成的单细胞和单核 MF 图谱

通过整合来自 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的 MF 数据,我们获得了 87,522 个细胞和细胞核,聚类为六个主要群体(图 3b 和扩展数据图 4a)。其中,2个群体为I型慢肌纤维(MF-I)和II型快肌纤维(MF-II),其余4个群体可能是分离过程中产生的MF片段(Fig. 3d,扩展数据图4b和补充说明4)。主要群体进一步细分为总共12个单核(图3a)和7个单细胞(图3c)亚群。
在单核群体中,我们鉴定了参考MF-I和MF-II细胞核以及配对FAM189A2 (I-FAM 和 II-FAM)和 OTUD1 (I-OTU 和 II-OTU)核状态,它们同时存在于慢抽搐和快抽搐 MF 中(扩展数据图 4c、d)。我们还观察到三个特殊的肌核群体,即神经肌肉接头 (NMJ)、肌腱接头和以前未报道的 NMJ 附件(扩展数据图 4c、d)。在单细胞群体中,我们观察到两种以 MYH8 和 ,分别和5个MF片段群(扩展数据图4c,d)。有趣的是, 肌细胞表达胎儿肌球蛋白重链 除了 ,表明活跃的肌生成。RASA4型 肌细胞表达生长感应调节因子 mTORC1 的激活因子,即 FLCN/FNIP1 复合物和 GTP 酶激活蛋白 RASA4,因此可能参与肌肉生长 .
通过研究细胞组成的衰老相关变化,我们发现配对FAM189A2 和 OTUD1 MF类型的肌核随年龄而不同(图3e和扩展数据图4e,f)。通常,配对FAM189A2 细胞核(I-FAM 和 II-FAM)显示相同标记基因的表达,包括 NAMPT,它编码一种参与 新陈代谢 ,以及应激反应基因 STAT3(参考文献 48)和 SOCS3(参考文献 49),它们由细胞因子信号传导激活(图 3f)。有趣的是,I-FAM状态(慢抽搐MF特异性)随着年龄的增长而降低,而II-FAM状态(快抽搐MF特异性)没有变化(图3e和扩展数据图4e)。减少数量 RNAscope也证实了慢抽搐MF中的细胞核(图3g)。鉴于据报道 STAT3 信号传导是肌肉修复所必需的 ,IL-4 和 IL-13 信号通路富集FAM189A2 细胞核 (扩展数据 Fig. ),我们假设这些状态可能对细胞因子信号有反应,并可能参与 MF 修复。
奥图德1 成对的细胞核在基因表达上的相似性不如FAM189A2 状态(图 3h)。然而,他们仍然显示出同一组基因(OTUD1、CREB5、XIRP1、DNAJA4、TNFRSF12A等)的上调,这些基因涉及肌肉发育、分化和对损伤的反应 ,与基线MF-I和MF-II状态相比(图3 h和扩展数据图4g)。OTUD1 和 TNFRSF12A mRNA 在慢抽搐和快抽搐 MF 中原位共表达(扩展数据图 1)。 ),尽管存在排他性 OTUD1 和 TNFRSF12A 表达的病例,表明人群存在异质性。有趣的是,与I-OTU相比,II-OTU核随着年龄的增长而增加(图1)。 和扩展数据图4e),并且具有更强的TNFRSF12A表达(已知促进肌肉萎缩的TWEAK配体的受体 )和应激反应和凝血基因(JUNB、ERCC1、GADD45A、THBD和ANXA5)(图3h,i)。总之,这些数据表明,随着年龄的增长,快抽搐(II 型)MF 的退行性更强。
NMJ 是神经和 MF 之间的接口,由三个主要组成部分组成:突触前轴突末梢,产生乙酰胆碱;MF 上的突触后运动终板,其中包含乙酰胆碱受体 (AChRs) 簇;和保护突触的终末雪旺细胞。对不同年龄的挑逗人肋间肌中的 NMJ 成分进行染色显示 AChR 簇(扩展数据图 5a)、雪旺细胞和轴突(未定量)减少,这与文献中描述的与年龄相关的 NMJ 变性一致 .
It is well known that NMJ nuclei are located beneath the endplate and produce essential components of the synaptic apparatus. In the
众所周知,NMJ 细胞核位于终板下方,并产生突触装置的基本组成部分。在

Fig. 2 | Mechanistic insights into human MuSC aging. a, UMAP visualization of MuSC subpopulations identified from scRNA-seq. b, Tree visualization of the GO terms enriched among marker genes for every MuSC subpopulation. Top 10 clusters of GO terms defined based on semantic similarity are shown. c, Beeswarm Milo plot showing the distribution of
图 2 | 人类 MuSC 衰老的机制洞察。a,UMAP 可视化 MuSC 单细胞 RNA 测序鉴定出的亚群。b,GO 术语的树状可视化显示出每个 MuSC 亚群标记基因富集的 GO 术语。根据语义相似性定义的前 10 个 GO 术语群集被展示。c,蜜蜂图 Mlio 绘制显示了对不同批次和一次批次间 MuSC 对数变化的分布情况。
in cell abundance with age across neighborhoods of MuSC subtypes; significantly differentially abundant neighborhoods are colored. d, Ribosome biogenesis enrichment score of MuSC subpopulations in young (five donors) versus aged (seven donors) individuals. value: two-tailed Mann-Whitney-Wilcoxon test. . e, Dot plot of ribosome biogenesis and RNA polymerase I complex genes in MuSC subpopulations. Dot size represents the proportion of cells expressing the gene in aged group, color represents in young versus aged. Significantly upregulated and downregulated genes were defined using the direction of (FC), the proportion of cells and LTSR (significance value, ranging from 0 to 1 , where 1 is confident estimate). See Source Data. , Expression of senescence-associated and ribosome assembly (h) genes in cultured human primary myoblasts (f) by both qPCR (three biological repeats per group) (g,h) and western blot . Three independent experiments were performed for western blot with similar results. value: unpaired two-tailed -test. ; . Illustration in was created with BioRender.com. , qPCR (three donors for both panels) of genes in FACS-sorted MuSC subpopulations. value in k: one-way ANOVA test; value in I: unpaired two-tailed -test. ; , Violin plots of CCL2, TNFAIP 3 and NFKBIZ in ICA MuSCs from scRNA-seq data. P value: unpaired two-tailed -test. n, qPCR of CHUK, NFKBIZ and CCL2 in FACS-sorted ICA MuSCs (three young versus three or four aged donors). value: unpaired two-tailed -test. . All data presented in and are mean s.e.m. with individual data points shown. The exact 值显示在源数据中。在本研究中,我们发现了一个以前未报道的 NMJ 辅助群体,该群体表达了与突触形成相关的标记基因,这些标记基因与 NMJ 细胞核标记不同(图 3j 和补充 
表 4)。如GO分析所示,NMJ辅助物在“突触组织”和“轴突发育”方面富集,可能促进突触形成(扩展数据图4g)。在 NMJ 配件中 a
组细胞比例 (%) 细胞组成比例(%)
  • 0 O
1030507090 组内平均表达式 1030507090组内平均表达式
1.0
b

E H 
比例 0,75 0.00 (足球俱乐部) -0.3
比例 0.75 0.00 (足球俱乐部) -0.3

-0.4
意义 上下 1 g
i) 核糖体组装基因 ii) 衰老表型 f
j
k Main MuSC - ICA MUSC - MUSC
k 主要 MuSC - ICA MUSC - MUSC
m
n
n Young ICA Aged ICA
n 年轻 ICA 年老 ICA


marker genes were GRIA2, encoding the key subunit of ionotropic glutamate receptor; EFNA5, encoding an essential ligand involved in axon guidance to the myotube during limb development ; and SORBS2, encoding an adapter protein involved in AChR cluster formation in mouse . pySCENIC transcription factor activity inference further confirmed the distinction between NMJ and NMJ accessory, highlighting that the ETV4 and ETV5 (ref.55) Transcription factors known to induce synapse formation were almost inactive in NMJ accessory (Extended Data Fig. 4i,j). Interestingly, NMJ accessory increased with age, both in our dataset and in publicly available human quadriceps nuclei data (Fig. 3e and Extended Data Fig. 5b,c). By co-staining CHRNE (NMJ nuclei) and GRIA2 (NMJ accessory) with RNAscope probes, we observed groups of nuclei with co-localization of these transcripts in aged donor tissue sections, which were rare in young ones (Fig. 3k). NMJ accessory also expressed more slow-twitch rather than fast-twitch MF markers (Extended Data Fig. 5d), which was also evident from RNAscope staining (Fig. 3k and Extended Data Fig. 5e; NMJ accessory in fast-twitch MFs was rarely present-data not shown). Using immunofluorescence, we identified SORBS2 nuclei directly beneath the postsynaptic endplate (as marked by -bungarotoxin staining) at the NMJ (Fig. 3l).
标记基因是 GRIA2,编码离子型谷氨酸受体的关键亚基;EFNA5,编码在肢体发育期间对肌管进行轴突引导的重要配体 ;以及 SORBS2,编码在小鼠 AChR 簇形成中涉及的适配器蛋白。pySCENIC 转录因子活性推断进一步确认了 NMJ 和 NMJ 辅助之间的区别,突出显示 ETV4 和 ETV5(参考文献 55)已知能诱导突触形成的转录因子在 NMJ 辅助中几乎不活跃(扩展数据图 4i,j)。有趣的是,NMJ 辅助随着年龄增长而增加,无论是在我们的数据集中还是在公开可用的人类股四头肌细胞核数据中(图 3e 和扩展数据图 5b,c)。通过共染色 CHRNE(NMJ 细胞核)和 GRIA2(NMJ 辅助)与 RNAscope 探针,我们观察到在年长供体组织切片中这些转录本的共定位的细胞核群,而在年轻供体中很少见(图 3k)。NMJ 辅助还表达更多的慢肌而不是快肌 MF 标记物(扩展数据图 5d),这也可以从 RNAscope 染色中看出(图 3k 和扩展数据图)。 5e; NMJ 的快收缩 MFs 中的附件很少出现-未显示数据)。使用免疫荧光,我们在 NMJ(图 3l)下直接确定了 SORBS2 核,位于肌肉运动柄过后的区域(由 -曼巴毒蛋白标记)。
To better understand the functional importance of the NMJ accessory population, we cultured human myotubes in vitro, where they are able to mimic different stages of AChR cluster formation even without axonal stimulation . We then used this myotube culture to perform knockdown of two NMJ accessory markers, EFNA5 and SORBS2. Both knockdowns led to a marked decrease of AChR clusters at all stages of aggregate assembly (Fig. and Extended Data Fig. ), whereas overexpression of EFNA5 on its own was sufficient to promote AChR cluster formation (Fig. 3n). Overall, this suggests that NMJ accessory increases with age to support NMJ re-innervation in aged MF (Fig. 30). We also observed a subset of denervation signature genes in NMJ accessory nuclei; however, they were not exclusive to NMJ accessory (Extended Data Fig. 5g).
为了更好地理解 NMJ 附件群体的功能重要性,我们在体外培养了人类肌肉束,它能在没有轴突刺激的情况下模拟不同阿 ChR 聚集形成阶段 。然后,我们使用这种肌束培养进行了两种 NMJ 附件标记物 EFNA5 和 SORBS2 的基因沉默。这两种沉默导致了所有聚集形成阶段的 AChR 集群显著减少(图 和扩展数据图 ),而单独过表达 EFNA5 就足以促进 AChR 集群的形成(图 3n)。总的来说,这表明 NMJ 附件在年龄增长时增加以支持老化 MF 的 NMJ 再神经化(图 30)。我们还观察到 NMJ 附件中一部分解神经标记基因 ; 但是,它们并不是 NMJ 附件的专有(扩展数据图 5g)。

Mechanisms countering fast-twitch MF loss in aging
缓解快收缩 MF 老化的机制

MFs have differential susceptibility to aging depending on their type: fast-twitch MFs are more vulnerable than slow-twitch ones . Here, we combined information about MFs and nuclei comprising them to compare their dynamics with age (Fig. 4a). For the MF, we used immunofluorescence staining of myosin heavy chain proteins (Fig. 4b) followed by automatic image analysis (Extended Data Fig. 6a,b and Methods) to distinguish slow-twitch (type I, MYH7'), fast-twitch (type IIA, MYH2 , and type IIX, ) and hybrid (type IIA-IIX and ) MFs. We then scored the expression of the same genes in the nuclei and were able to separate three pure nuclei types, with exclusive expression of or , as well as four hybrid types, , and (Fig. and Supplementary Table 5).
肌纤维根据其类型对衰老的敏感性有差异:快收缩型肌纤维比慢收缩型更容易受损。在这里,我们结合了有关肌纤维和构成它们的细胞核的信息,比较它们随着年龄的动态变化。对于肌纤维,我们使用肌球蛋白重链蛋白的免疫荧光染色,然后进行自动图像分析,以区分慢收缩型(I 型,MYH7')、快收缩型(IIA 型,MYH2)和混合型(IIA-IIX 和 IIX 型)肌纤维。然后我们评分核中相同基因的表达,并能够区分三种纯核类型,具有独特的表达,以及四种混合类型。
As expected, fast-twitch MFs displayed reduced heterogeneity in aged compared to young intercostal muscles as determined by immunofluorescence (Fig. 4b). Both slow-twitch and fast-twitch MFs decreased in cross-sectional area, with type IIA MFs exhibiting the greatest reduction in size (Extended Data Fig. 6c,d). Detailed MF typing revealed that type IIX MFs almost completely disappeared in aged individuals; type IIA and hybrid IIA-IIX did not significantly change; and type I increased in proportion (Fig. 4c, Extended Data Fig. 6e and Supplementary Table 5).
预期的是,快收缩MFs在老年人肋间肌中显示出较年轻时减少的异质性,这是通过免疫荧光确定的(图4b)。慢收缩和快收缩MFs的横截面积均减少,其中IIA型MFs的尺寸减小最为显著(扩展数据图6c,d)。详细的MF分类显示,IIX型MFs在老年人中几乎完全消失;IIA型和混合型IIA-IIX型没有显著变化;而I型的比例增加(图4c,扩展数据图6e和附表5)。
At the nuclei level, nuclei (type IIX) had a tendency to increase (Fig. 4e and Extended Data Fig. 6f), even though the type IIX MFs that are expected to contain these nuclei almost disappeared with age. This may point to initiation or increase of expression in other MF types (such as type I ) and type II (MYH2 ) and acquisition of an early hybrid phenotype. By combining staining of MYH7 protein together with and RNA (Extended Data Fig. ), we observed a number of nuclei in aged slow-twitch MFs expressing fast-type mRNAs and (Fig. 4 f and Extended Data Fig. 7a). These fast type mRNAs were even found in the cytoplasm (Fig. and Extended Data Fig. 7a), a sign of hybrid MF, which was not observed in young skeletal muscle. Notably, slow-type nuclei were located only in slow-twitch MFs (Extended Data Fig. 6h). Together, this points to a 'slow-to-fast' myonuclear shift in aged skeletal muscle, which can be an intermediate stage toward a hybrid MF phenotype. Interestingly, changes within slow-twitch MF were accompanied by an increase in glycolytic enzyme expression in the cytoplasm (as estimated using MF fragments) and a decrease in the nuclear expression of PPARGC1A, a key mitochondrial biogenesis gene (Extended Data Fig. 7b). This agrees with previous proteomics data but is unexpected given the oxidative nature of slow-twitch MF metabolism. We also observed an increase in RNA inside the nuclei and cytoplasm of (Fig. and Extended Data Fig. 7c), pointing to an additional 'fast IIA-to-fast IIX' nuclear shift. The appearance of such hybrid states may be a response to a loss of fast-twitch MF in aging.
在细胞核水平, 细胞核(IIX型)有增加的趋势(图4e和扩展数据图6f),尽管预期包含这些细胞核的IIX型肌纤维随着年龄增长几乎消失。这可能指向其他肌纤维类型(如I型 )和II型(MYH2 )中 表达的启动或增加,以及早期混合表型的获得。通过结合MYH7蛋白的染色以及 RNA(扩展数据图 ),我们观察到在老年慢肌 肌纤维中表达快速型mRNA 的许多细胞核(图4f和扩展数据图7a)。这些快速型mRNA甚至在细胞质中发现(图 和扩展数据图7a),这是混合肌纤维的迹象,而在年轻骨骼肌中没有观察到。值得注意的是,慢型 细胞核仅位于慢肌肌纤维中(扩展数据图6h)。总的来说,这表明在老年骨骼肌中存在“慢到快”的肌核转变,这可能是通向混合肌纤维表型的中间阶段。 有趣的是,慢肌纤维内的变化伴随着细胞质中糖酵解酶表达的增加(使用MF碎片估计)和线粒体生物发生关键基因PPARGC1A的核表达减少(扩展数据图7b)。这与先前的蛋白质组学数据一致,但考虑到慢肌纤维的氧化代谢特性,这种情况是意外的。我们还观察到核内和细胞质中的RNA增加(图15和扩展数据图7c),指向额外的“快IIA到快IIX”的核转变。这种混合状态的出现可能是对老化中快肌纤维丢失的一种响应。
MYH8 myocyte-mediated regeneration may represent another mechanism countering fast-twitch MF loss. In particular, myocytes were an intermediate state in the trajectory from MuSC to MF, predominantly connecting to fast-twitch MF (Extended Data Fig. 7d,e). This is consistent with fetal MYH8 being described as a marker of muscle regeneration . MYH8 myocytes also expressed a much higher level of fast-twitch rather than slow-twitch MF structural genes and increased in proportion with age (Fig. ,i and Supplementary Table 5), as recently reported . Immunofluorescence staining confirmed that MYH8 expression significantly increased with age (Fig. 4j) and predominantly occurred in fast-twitch MFs (Fig. 4k). Moreover, nearly of fast-twitch MFs had centralized nuclei (Fig. 41), a sign of regeneration. This is similar to a process identified in Duchenne muscular dystrophy where atrophic fast-twitch MFs regenerate by de novo expression of embryonic myosin heavy chain 3 (MYH3) .
MYH8肌细胞介导的再生可能代表了另一种对抗快收缩MF损失的机制。特别是,MYH8肌细胞是从MuSC到MF的轨迹中的中间状态,主要连接到快收缩MF。这与胎儿期的MYH8被描述为肌肉再生标记是一致的。MYH8肌细胞也表达了比慢收缩MF结构基因更高水平的快收缩MF,并且随着年龄增加而比例增加。免疫荧光染色证实,MYH8表达随着年龄显著增加,并主要发生在快收缩MF中。此外,近一半的快收缩MF具有核心核(中心核),这是再生的迹象。这类似于杜兴氏肌肉萎缩症中鉴定出的过程,其中萎缩的快收缩MF通过新表达胚胎肌球蛋白重链3(MYH3)进行再生。
In summary, our data suggest two putative mechanisms countering fast-twitch MF loss: a 'slow-to-fast' myonuclei shift and an increase in fast-twitch MF regeneration via MYH8 myocytes (Fig. ).
总的来说,我们的数据表明有两种可能的机制来对抗快速收缩肌纤维的流失:一种是“慢到快”的肌核转变,另一种是通过MYH8肌细胞增加快速收缩肌纤维再生(图1)。
staining of NMJ accessory (in yellow circle) on intercostal muscle FFPE sections (two young versus three aged donors). Scale bar, , Immunofluorescence staining of -bungarotoxin ( -BTX) and SORBS2 on teased human intercostal muscles (one young versus two aged donors). Scale bar, . , Immunofluorescence of AChRs on cultured human myotubes after siRNA knockdown of EFNA5 ( , left, 13 si-EFNA5 versus eight Scramble control fields) and overexpression of EFNA5 (n, left, eight OE-EFNA5 versus 11 control fields). AChRs on different stages of cluster formation (dotted to plaque to branched) were quantified by Fiji. value: unpaired two-tailed -test. Scale bar, . Both experiments in and were performed twice with similar results. , Schematic diagram showing NMJ accessory-mediated pro-survival mechanism against NMJ aging. All data presented in bar plots are mean s.e.m. with individual data points shown. ; . The exact values are shown in the Source Data.
NMJ 附件(黄色圆圈内)在肋间肌 FFPE 切片上的染色(两个年轻对比三个年长的供体)。比例尺, ,人类肋间肌上的拉开式免疫荧光染色(一个年轻对比两个年长的供体)-β-蝮蛇毒素( -BTX)和 SORBS2。比例尺, ,EFNA5 的 siRNA 敲除后培养的人类肌管上的 AChRs 的免疫荧光( ,左,13 个 si-EFNA5 对比八个 Scramble 对照区域)和 EFNA5 的过表达(n,左,八个 OE-EFNA5 对比 11 个对照区域)。 Fiji 对不同阶段的簇形成的 AChRs 进行了定量。 值:未配对的双尾 -test。比例尺, 中的两次实验结果相似。 ,示意图显示 NMJ 附件介导的 NMJ 抗衰老机制。所有条形图中呈现的数据 均为均值 s.e.m.,显示个体数据点。 。源数据中显示确切的 值。

The human skeletal muscle microenvironment in aging
老化中的人类骨骼肌微环境

To further investigate the aging muscle microenvironment, we separated and finely annotated major cell populations, including immune cells, fibroblasts, Schwann cells, endothelial cells and SMCs (Supplementary Note 4, Extended Data Figs. 8 and 9a and Supplementary Table 6), and used Milo to study changes in cellular neighborhoods with age.
为进一步研究老化肌肉微环境,我们分离并精细注释了主要细胞群,包括免疫细胞、成纤维细胞、施万细胞、内皮细胞和 SMC(附注 4、扩展数据图 8 和 9a,以及补充表 6),并使用 Milo 来研究细胞邻域随着年龄的变化。

We found that B cells,
我们发现 B 细胞,
cells and NK cells accumulated with age, whereas M2 macrophages decreased (Fig. 5a). Immunofluorescence confirmed that and cells increased with age across individuals (Fig. 5d-f and Extended Data Fig. 9b). In parallel, we also performed 15-plex immunofluorescence staining on young and aged muscle sections using the RareCyte commercial panel of ArgoFluor-conjugated antibodies to visualize subtypes of immune cells, vascular cells and a
和 NK 细胞随着年龄积累,而 M2 巨噬细胞减少(图 5a)。免疫荧光证实了 细胞在个体间随年龄增加(图 5d-f 和扩展数据图 9b)。与此同时,我们还使用 RareCyte 商业 ArgoFluor 偶联抗体的 15-plex 免疫荧光染色在年轻和老化的肌肉切片上进行,以可视化免疫细胞、血管细胞和
b
e
f
c
d
i
Fraction of cells in group (%) - 000 20406080100 Mean expression in group
组中细胞的分数 (%) - 000 20406080100 组中的平均表达
j

o
NMJ accessory NMJ 附件
NMJ

a
c
e
h
i
图4 |对抗衰老中快速抽搐 MF 丢失的机制。a,目前对肌纤维及其各自细胞核的一般类别的理解示意图。插图使用BioRender创作。com.b,c,人肋间肌肉中不同MF类型的免疫荧光染色(b)和比例变化(c)(7名年轻供体和4名老年供体)。比例尺, . 值:不成对的双尾 -测试。d,e, 基于肌核表达的肌核类型三维散点图 ( 轴), ( axis) 和 ( 轴)来自snRNA-seq(方法;未分类的群体不显示, )及其在老龄化中的比例变化(e)(5名年轻捐赠者与5名老年捐赠者)。三个供体(502B、582C 和 583B),比例高 ( )的未分类种群被丢弃。 值:不成对的双尾 -test.f,g, 联合RNAscope( )与免疫荧光 (MYH7) 突出了慢抽搐 (f) 和快抽搐 (g) 的细胞核(中)和细胞质(右)内快速型 mRNA(尤其是 MYH1)的上调
m
with age. Scale bar, . , Violin plot showing specific expression of fast-twitch MF structural genes in myocytes. , Bar plot showing proportion of myocytes, relative to the total MF cells in scRNA-seq (five young versus seven aged donors). value: unpaired two-tailed -test. j, Immunofluorescence (left) and area quantification (right) of MYH8 on teased human intercostal muscles (six young versus six aged donors). value: unpaired two-tailed -test. . Scale bar, , Co-immunofluorescence of MYH7, MYH2 and MYH8 on skeletal muscle cross-sections with lower (k) and higher (I) magnification. Bar plots illustrate proportion of MFs with centralized nuclei relative to all MYH2 MFs (five young versus four aged donors). Arrows point to MYH MFs. Scale bar in . Scale bar in . value: unpaired two-tailed -test. , Diagram illustrating different putative mechanisms of MF aging. All data in c,e,i,j and I are mean s.e.m. with individual data points shown. The exact values are shown in the Source Data.
随着年龄增长。比例尺,。小提琴图显示快速肌纤维结构基因在肌细胞中的特定表达。条形图显示相对于scRNA-seq中总MF细胞的比例(五个年轻对比七个老年供体)。值:未配对的双尾t检验。j,MYH8在拉开的人肋间肌上的免疫荧光(左)和面积定量(右)。值:未配对的双尾t检验。。比例尺,,MYH7、MYH2和MYH8在骨骼肌横截面上的共免疫荧光,放大(k)和放大(l)。条形图说明相对于所有MYH2 MF的中心化核的MF比例(五个年轻对比四个老年供体)。箭头指向MYH MF。比例尺在。值:未配对的双尾t检验。,图示MF老化的不同假设机制。c、e、i、j和I中的所有数据均为均值s.e.m.,显示各个数据点。 精确的 值显示在源数据中。
d
e
  • Young 年轻
  • Aged 年长

I
Young larger vasculature Aged larger vasculature
年轻时较大的血管 结老时较大的血管
Fig. 5 | The human skeletal muscle microenvironment in aging. a-c, Beeswarm Milo plots showing the distribution of -transformed fold change in cell abundance with age across neighborhoods of cells in the microenvironment. AdvFB, adventitial fibroblasts; EnFB, endoneurial fibroblasts; PnFB, perineural fibroblasts.d, Co-immunofluorescence of CD3 and laminin on fresh-frozen sections. Bar plot showing number of cells per field (four young versus six aged donors). Scale bar, . : unpaired two-tailed -test. . e, Subset of four markers from a 15-plex RareCyte protein panel indicating proximity between cells and vessels (two young versus two aged donors). Scale bar, . , Co-immunofluorescence of NKG7 and laminin on fresh-frozen sections. Bar plots show the number of cells per (three young versus four aged donors). Scale bar, . : unpaired two-tailed t-test. . , RNAscope (g) and bar plot (h) showing number of LYVE1 cells per field on FFPE sections (two young versus two aged donors). Scale bar, . : one-way
图5 | 老化中的人类骨骼肌微环境。a-c,蜂群Milo图显示细胞丰度的 -转换倍数随年龄在微环境中细胞邻域的分布。AdvFB,外膜成纤维细胞;EnFB,内神经鞘成纤维细胞;PnFB,周神经鞘成纤维细胞。d,新鲜冰冻切片上CD3和层粘蛋白的共免疫荧光。条形图显示每个视野中的 细胞数量(四个年轻对比六个老年供体)。比例尺, :未配对的双尾 -检验。 。e,来自15-plex RareCyte蛋白质面板的四个标记子集,指示 细胞与 血管之间的接近程度(两个年轻对比两个老年供体)。比例尺, ,新鲜冰冻切片上NKG7和层粘蛋白的共免疫荧光。条形图显示每个 细胞数量(三个年轻对比四个老年供体)。比例尺, :未配对的双尾t检验。 ,RNAscope(g)和条形图(h)显示FFPE切片上每个视野中LYVE1细胞的数量(两个年轻对比两个老年供体)。比例尺, : 单向

h

ANOVA test. , Co-immunofluorescence of ACTA2 and laminin on fresh-frozen sections (i) and bar plot illustrating proportion of MFs with 0 (none), or more cells surrounding them (j) (three young versus three aged donors). Scale bar, . : unpaired two-tailed -test. . , Dot plot illustrating aging changes of chemokine and interleukin genes. Significant genes were defined based on direction of change, proportion of cells and LTSR (significance) , Co-immunofluorescence of ACTA2 and CCL2 on FFPE sections. Bar plot shows percentage of cells (two young versus two aged donors). Scale bar, . value: one-way ANOVA test. . , CellPhoneDB analysis of cell-cell interactions mediated via CCL 2 produced by various cell types in the microenvironment. Emitter (ligand) cells: leftmost; receiver (receptor) cells: rightmost. FB, fibroblast. All data in and are mean s.e.m. with individual data points shown. See the Source Data for exact values.
ANOVA 测试。