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由美国化学学会出版。1155 Sixteenth Street N.W.， Washington， DC 20036 由美国化学学会出版。版权所有©美国化学学会。但是，美国政府原创作品或任何英联邦国家政府雇员在履行职责过程中制作的作品均不主张版权。
品
高效单锅无疤痕金门组件
Mohammad HamediRad、Scott Weisberg、Ran Chao、Jiazhang Lian 和 Huimin Zhao
ACS 合成器。Biol.， 刚刚接受的手稿 • DOI： 10.1021/acssynbio.8b00480 • 出版日期 （Web）： 23 Apr 2019
2019年4月23日从 http://pubs.acs.org 下载
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提交至 ACS Synthetic Biology
高效单锅无疤痕金门组件
穆罕默德·哈梅迪拉德、斯科特·韦斯伯格、赵冉、
Jiazhang Lian， 和 Huimin Zhao
1
Carl R. Woese 基因组生物学研究所
2
化学与生物分子工程系
3
生物化学系
4
浙江大学化学与生物工程学院， 杭州， 中国
5
当前地址： LifeFoundry， Inc.， 60 Hazelwood Dr.， Champaign， IL， 61820
6
伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学和生物工程系，伊利诺伊州厄巴纳
61801
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这些作者的贡献相同
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抽象
Golden Gate 组装是使用最广泛的 DNA 组装方法之一，因为它具有稳健性和
模块性。然而，尽管它很受欢迎，但需要不含 BsaI 的部件，引入之间的疤痕
连接，以及缺乏对连接子的全面研究，阻碍了其更广泛的使用。
在这里，我们首先开发了一种新的测序方案来测试 96 个 4- 连接子的效率和特异性
bp 长度，并通过实验验证了这些接头及其对金门装配效率的影响
和特异性。然后，我们使用这些测序数据生成了 200 个不同的接头集，这些接头集可以用于
社区执行不同规模和复杂性的高效金门集会。我们还
提出单锅无疤痕的金门组件和 BsaI 移除方案及其随附的
装配设计软件，用于执行点突变和金门装配。此装配方案
通过在装配附近选择优化的接头，在不影响效率的情况下实现无疤痕装配
结。
关键词：DNA组装，金门组装，合成生物学
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介绍
DNA组装是最基本的技术之一，通常是第一步
合成生物学和代谢工程。从重组DNA到重组DNA的各种技术
1970 年代的技术到现代 DNA 组装技术使科学家能够使
在生命的各个领域进行修改，以适应各种应用。无数种不同的方式
组装DNA已经开发出来并提交给科学界。这些方法组装
使用不同的方法（如限制性酶切）以特定顺序将多个 DNA 分子组合在一起-
连接、基于同源性和基于桥接寡核苷酸的组装。
使用最广泛的 DNA 组装技术之一是 Golden Gate 方法及其
变化，这要归功于它们的坚固性和模块化性质。在这种方法中，IIS型核酸内切酶是
使用，它切断了它们的识别序列之外，可以产生任何可能的 4 bp 粘性末端。这些
然后，粘性末端可以退火并连接到相应的粘性末端，从而形成
所需的顺序。IIS 型限制性内切酶（最常见的是 BsaI）的灵活性提供了
对金门装配的模块化程度和鲁棒性，使其成为使用最广泛的DNA之一
克隆方法。
尽管有这些优点，但金门组装还是有一些局限性。中使用的所有部件
组装时应不含IIS型限制性内切酶，避免消化中间和中间的零件
大大降低了装配效率。鉴于大多数类型的识别长度相对较短
IIS限制性内切酶，最常见的是BsaI，其识别位点在生物部位比较常见
并且必须通过沉默突变去除。此外，Golden Gate 组件在
可能影响功能的 DNA 部分，尤其是在添加起始密码子的上游区域
的多个核苷酸可以显着改变表达水平。4 bp 悬垂或粘性末端
在消化步骤之后生成的用于以正确顺序组装零件（接头）是其中之一
设计金门反应的关键因素。金门机场使用的 4 bp 接头的选择
事实证明，装配对于装配的成功和效率至关重要。
关于基于计算和
实验数据。已经提出了一些选择有效链接器的一般准则，并且
已经开发了一款软件来按照这些准则生成许多有效的链接器。
在其他地方也评估了所有可能的 4-bp 接头，并确定了几个有效的接头组
并提出。然而，这些研究都没有提供一份广泛的实验验证清单
高效的 4 bp 接头。由于这些研究的目标不同，没有解决无疤痕的金门问题
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