铁死亡应激促进适应不良肾修复中促炎近端肾小管细胞的积累
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利益争夺：作者声明不存在利益争夺。
资金： 见第 26 页 收稿日期： 2021-03-20 预印本：2021 年 3 月 23 日 录用日期： 2021-07-17 发布日期：2021 年 7 月 19 日 审校编辑：Gregory G Germino，美国国立卫生研究院 © 版权所有 Ide et al.本文根据 Creative Commons Attribution License 的条款进行分发，该许可允许不受限制地使用和重新分发，前提是注明原作者和来源。
抽象 压倒性的脂质过氧化诱导铁死亡应激和铁死亡，这是一种非凋亡形式的调节细胞死亡，与小鼠和人类的适应不良肾脏修复有关。使用单细胞转录组学和小鼠遗传学方法，我们表明近端肾小管 （PT） 细胞在损伤后会发展出分子上不同的促炎状态。虽然这些炎症性 PT 细胞在轻度损伤后短暂出现并恢复到原始状态而不会诱导纤维化，但在严重损伤后，它们会积累并导致持续炎症。这种瞬时炎症 PT 状态显着下调谷胱甘肽代谢基因，使细胞容易受到铁死亡应激。轻度损伤后，这些细胞中高铁死亡应激的基因诱导导致炎性 PT 细胞的积累，从而增强炎症和纤维化。我们的研究将铁死亡应激的作用从作为调节细胞死亡的触发因素扩大到包括促炎细胞的促进和积累，这些细胞是适应不良修复的基础。
介绍 在美国，每年有 120 万住院患者患有急性肾损伤 （AKI）;20-50% 的 AKI 幸存者发展为慢性肾病 （CKD），增加了他们患透析依赖、心血管事件和死亡的风险（Chawla 等人，2014 年;Lewington 等人，2013 年;Strausser等人，2018 年）。除了一般支持性治疗外，没有治疗 AKI 或防止 AKI 向 CKD 过渡的靶向疗法。需要更好地了解支撑 AKI 到 CKD 转变的分子事件，以开发治疗策略来中断这一毁灭性的疾病过程。
临床和临床前研究已经确定，严重 AKI 后近端肾小管 （PT） 上皮细胞的损伤是驱动向 CKD 过渡的关键机制（Strausser等人，2018 年;Chawla 等人，2011 年;Liu et al.， 2017;Cippà等人，2018 年;Ferenbach 和 Bonventre，2015 年;Humphreys，2018 年）。PT 细胞受急性缺血和毒性损伤的影响最严重，因为它们需要维持体液正常稳态的高代谢和能量密集型转运蛋白活动（Ferenbach 和 Bonventre，2015 年;Humphreys，2018 年;Gewin，2018 年）。在肾脏 修复过程中，受损的 PT 细胞采用异质分子状态（Kirita等人，2020 年）。它们重新激活在肾脏发育过程中通常活跃的基因（Rudman-Melnick等人，2020 年;Kang等人，2016 年;Kumar等人，2015 年），改变它们对代谢燃料的依赖性（Legouis等人，2020 年），改变它们的形态，并增殖以补充近端小管中裸露的上皮区域（Ferenbach 和 Bonventre，2015 年;Witzgall et al.， 1994）。当肾脏的初始损伤轻微时，PT 细胞随后通过再分化恢复到原始状态，炎症和纤维化消退（Ferenbach 和 Bonventre，2015 年;Kirita等人，2020 年;RudmanMelnick 等人，2020 年;Legouis等人，2020 年;Witzgall 等人，1994 年;Berger等人，2014 年;Kusaba et al.， 2014）。然而，如果损伤更广泛、更持久或反复出现，受损细胞将无法再分化，导致持续炎症、纤维化并最终导致细胞死亡。对严重损伤后肾修复失败期间控制近端肾小管异质性和细胞命运的分子途径知之甚少。这种知识差距阻碍了基于潜在疾病机制的疗法的开发。
参与 AKI 发病机制和近端肾小管细胞死亡的关键途径之一是铁死亡，这是一种独特的非凋亡形式的调节细胞死亡（Stockwell等人，2017 年;Dixon等人，2012 年;Yang et al.， 2014;Kagan et al.， 2017;Doll et al.， 2017;Alim et al.， 2019;Zhao et al.， 2020;Linkermann et al.， 2014）。脂质过氧化物的产生及其解毒之间的不平衡导致脂质过氧化物的压倒性积累（铁死亡应激），从而引发铁死亡（Stockwell等人，2017 年;Alim et al.， 2019）。谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶 4 （GPX4） 轴是防止铁死亡应激和铁死亡的中枢防御途径（Stockwell等人，2017 年;Dixon等人，2012 年;Yang et al.， 2014;Friedmann Angeli et al.， 2014）。小鼠中 Gpx4 的整体基因缺失导致肾小管上皮死亡和急性肾损伤，将肾小管上皮细胞确定为最容易受到铁死亡应激的细胞类型之一（Friedmann Angeli等人，2014 年）。此外，谷胱甘肽和 NADPH 可用性的降低进一步使缺血再灌注损伤的肾脏容易受到铁死亡应激（Strausser等人，2018 年;Nezu et al.， 2017）。越来越多的证据表明，对铁死亡细胞死亡的药理学抑制可改善 AKI 的严重程度，而过量的铁死亡应激与患者肾脏修复失败有关，这表明了一个新的治疗靶点（Zhao等人，2020 年;Linkermann等人，2014 年;Friedmann Angeli 等人，2014 年;Wenzel et al.， 2017）。有趣的是，最近的证据表明，坏死性凋亡的分子调节因子（另一种形式的调节性细胞死亡）通过独立于它们在触发细胞死亡中的作用而有据可查的其他途径促进疾病发病机制（Daniels 等人。, 2017;Moriwaki 和 Chan，2016 年;Moriwaki et al.， 2014）。然而，除了诱导铁死亡细胞死亡和功能肾小管细胞丢失之外，铁死亡应激是否在 AKI 及其后遗症的发病机制中具有其他作用仍不清楚。
在这里，使用互补的单细胞转录组学和小鼠遗传学方法，我们确定了分子不同的、与损伤相关的 PT 细胞状态的作用，该状态在成功与失败的修复过程中受到动态和差异调节。此外，我们提供了机制证据表明，PT 细胞中的铁死亡应激除了触发细胞死亡外，还增强了这种损伤相关状态，从而促进了肾脏修复失败和 AKI 到 CKD 的转变。
结果 肾小管上皮细胞在严重损伤后表现出异质性分子状态 为了确定严重肾损伤后促进适应不良修复的细胞机制，我们首先开发并优化了缺血再灌注诱导损伤 （IRI） 后“成功”与“失败”肾脏修复的小鼠模型。这是通过将肾缺血时间从成功恢复的 20 分钟延长到恢复失败的 30 分钟来实现的（图 1 - 图补充 1 和图 1 - 图补充 2）。轻度损伤后，组织学检查显示炎症和巨噬细胞蓄积在 21 天内消退 （缺血时间 20 分钟;图 1 - 图补充 1，D 和 E）。相比之下，严重损伤后出现进行性上皮损伤和纤维化，F4/80+ 巨噬细胞在受损上皮细胞周围积累持续至少 6 个月 （缺血时间 30 分钟;图 1 - 图补充 1、D 和 E;和图 1 - 图补充 2E）。
我们使用这种修复失败模型 （单侧 IRI，缺血时间 30 分钟） 生成肾修复失败的单细胞转录组图谱（图 1A）。在 IRI 后 6 小时和 1 、 7 和 21 天收获肾脏。获得了来自受伤肾脏 （IRI） 和稳态未受伤肾脏 （Homeo） 的总共 18,258 个细胞的高质量转录组数据（图 1、B 和 C）。使用 Seurat 集成算法对数据进行归一化并消除潜在的批量效应（Stuart等人，2019 年;Hafemeister 和 Satija，2019 年），我们整合了来自每种情况的转录组数据，并对集成数据集进行了无监督聚类分析。均匀流形近似和投影 （UMAP） 解析了 21 个独立的集群，代表不同的细胞类型（图 1B;图 1 - 图补充 3B 和图 1 - 图补充 4A）。根据已知的细胞类型特异性标记物确定每个簇的细胞身份（Park等人，2018 年;Ransick et al.， 2019）。我们成功地在缺血再灌注损伤 （IRI） 肾脏中选择性地鉴定了已知的细胞类型特异性损伤诱导基因，例如 Havcr1（肾损伤分子-1，KIM1）、Krt8（角蛋白 8）、Krt20（角蛋白 20）和 Lcn2（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，NGAL），但在稳态未受伤的对照肾脏中没有（图 1-图补充 3C）（Liu 等人，2017 年;Ichimura et al.， 2008;Paragas等人，2011 年）。
根据细胞聚集和基因表达模式，我们注意到我们的数据集中至少有三种上皮细胞状态（稳态正常、活化和去分化细胞）（参见图 1A，右图）。稳态正常细胞表达参与正常细胞功能和身份的“锚定”基因的高表达（图 1 - 图补充 3、B 和 C）。来自 IRI 肾脏的大多数管状上皮细胞强烈表达损伤诱导的基因（例如 Havcr1、Krt8、Krt20、Lcn2），表明它们处于激活状态（图 1 - 图补充 3C）。这些活化细胞和稳态细胞被归为同一簇，因为它们都高度表达正常肾小管上皮状态和功能的锚定基因特征（图 1、B 和 C;图，图 1 - 图补充 3C）。然而，我们还确定了其他与损伤相关的肾小管上皮簇（图 1C，箭头;DA-PT、DA-TAL 和 DA-DCT），其“正常”成熟上皮细胞标志基因的表达丢失或减少，但损伤诱导基因高度表达（图 1 - 图补充 3、B 和 C，图 1A）。
在这些损伤相关的上皮细胞簇中，我们发现了损伤相关的近端肾小管细胞状态（参见 DA-PT 簇），它显示稳态基因表达降低（例如 Lrp2、Slc34a1、Hnf4a 和 Acsm2）和与人和小鼠肾脏发育和肾损伤相关的基因富集（例如 Cdh6、Sox9、Sox4、Cited2、Vcam1、Vim 和 Havcr1;图 1D 和图 1 - 图补充 5B 和图 1 - 图补充 6A），（Combes等人，2019a;Famulski et al.， 2012;Adam et al.， 2017）。此外，该细胞群的基因本体富集分析揭示了促炎分子特征和趋化因子和细胞因子（如
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Cxcl2,Cxcl1,Ccl2 \mathrm{Cxcl} 2, \mathrm{Cxcl1}, \mathrm{Ccl} 2 在这种去分化炎症 PT 细胞状态中表达的损伤诱导基因中，我们专注于 Sox9 和 Vcam1 的富集（图 1D，参见 DA-PT 簇，箭头）。最近对小鼠 IRI 肾脏的单核转录组学分析发现血管细胞粘附分子 1 （VCAM1） 是非修复性近端肾小管状态的标志物（Kirita等人，2020 年），并且在多种形式的人类肾脏疾病中观察到 Vcam1 诱导，包括同种异体移植物排斥反应（Hauser等人，1997 年）。SRY-box9 （SOX9） 是急性缺血和毒性损伤后成功肾脏修复的重要转录因子（Kang等人，2016 年;Kumar et al.， 2015），并参与多个器官的发育，包括小鼠和人类肾脏 （Reginensi et al.， 2011）。SOX9 通过赋予干性、