从低到高的适应：蓝藻和微藻的 CO₂ 浓缩机制的更新

 抽象

微藻和蓝藻在环境大气 CO₂ 水平下在细胞内积累无机碳 （C） 于 20 世纪 80 年代首次被记录下来。因此，除了当时已知的 CCM 方案外，还揭示了第三种 CO₂ 浓缩机制 （CCM），它通过 C₃ 光合途径作用于水生光合自养生物，在 CAM 和 C₄ 高等植物中发挥作用。尽管微藻和蓝藻的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶 （Rubisco） 对 CO₂ 底物的亲和力低，并且 CO₂/O₂ 特异性低，但 CCM 允许它们在还原磷酸戊糖 （RPP） 循环中进行有效的 CO₂ 固定。CCM 基于战略位置的碳酸酐酶和 CO₂/HCO₃⁻ 吸收系统的协调运行。这种合作使 HCO₃⁻ 的细胞内积累成为可能，然后用于在 Rubisco 的活性中心附近产生高浓度的 CO₂ 分子，以补偿酶特性的缺点。CCM 作为 RPP 循环的附加组件，同时在光合作用的暗和光反应相互作用中充当重要的调节环节。本文总结了微藻和蓝藻中 CCM 分子和细胞组织研究的最新进展，以及其功能和调节的基本原理。

 1. 引言

微藻和蓝藻中细胞内无机碳 （C） 的积累是光合自养生物中可用的适应性机制之一，使它们能够进行有效的光合作用。

所有类型的光合碳代谢的核心元素是还原磷酸戊糖 （RPP） 循环（Calvin-Benson-Bassham 循环，C₃ 循环）。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶 （Rubisco） 是 RPP 循环的关键酶，将 CO₂ 与 1,5-二磷酸核酮糖 （RuBP） 结合。在许多光合自养生物中，Rubisco 的特征是对 CO₂ 的亲和力相当低 （K_M （_{CO 2}）） 和缓慢的羧化周转速率 （k_cat^c）。此外，Rubisco 是一种双功能酶，可同时执行羧化酶和加氧酶功能。加氧酶的活性将氧与 RuBP 而不是 CO₂ 结合，从而降低了碳固定的效率。除其他外，一些 Rubisco 酶具有低 CO₂/O₂ 特异性 （S_c/o），表明 CO₂ 作为底物的优势低于 O₂。氧合反应会大大降低光合作用效率，并且需要额外的能量用于光呼吸。在光呼吸过程中，CO 2 的损失可以达到 25-30%，而 CO₂ 的损失可以在 RPP 循环中固定 [1]。消耗一个 ATP 分子和一个 NADPH 分子来中和光呼吸的产物。

上述 Rubisco 特性在 [CO₂]/[O₂] 比率较低的现代氧化气氛中绝对至关重要。所有类型的 C 在水中的低扩散率是使水生物种情况恶化的另一个因素。正是由于这些原因，光合自养细胞已经发展出两种适应策略，使它们能够维持高光合生产力：（1） Rubisco 对 CO₂ 的亲和力增加，同时叶绿体中这种酶的量增加;（2） 细胞内 CO₂ 浓度的增加，以补偿 Rubisco 特性的缺点，即酶与其底物的直接饱和。

第一种策略是在通过 C₃ 类型的光合作用固定碳的高等植物中实施的。第二种策略由 Rubisco 羧化中心附近 CO₂ 积累的三种目前已知的方式表示。在高等陆地植物中，它是由于 C₄ 和 CAM 光合作用的方案实现的。水生光合微生物，即微藻和蓝藻，执行 C₃ 代谢并运行另一种类型的 CO₂ 浓度，这是基于将 C 直接“泵送”到细胞中。所有这些 CO₂ 浓缩策略都被称为“CO₂ 浓缩机制”（CCM）。在这里，我们将使用术语“CCM”来指代微藻和蓝藻细胞中的 CO₂ 浓缩机制。

缩写 CCM 通常被解读为“碳浓缩机制”，因为它的功能解决了两个问题：

• 
  C 的细胞内积累克服了其在从外部环境到 Rubisco 的途中扩散速率低的问题。因此，CCM 解决了光合作用的底物限制问题;
• 
  Rubisco 活性位点附近的 CO₂ 分子浓度补偿了其低底物特异性。

CCM 在分配给不同分类群的蓝藻和真核藻类中发挥作用 [2,3,4]。研究最深入的CCMs属于蓝藻的模式菌株（如集胞藻属菌株PCC 6803、细长聚球藻PCC 7942、聚球藻属菌株PCC 7002）和绿色微藻莱茵衣藻[5,6,7,8,9,10]。除了淡水和海洋物种外，CCM成分也存在于许多嗜碱性蓝藻中[11,12]。值得注意的是，这些生物生长在碳酸氢盐含量非常高的苏打湖中，理论上，它们不需要任何 CO₂ 浓度。同时，嗜碱蓝细菌被认为是存在于富含 CO₂ 的太古宙大气中的古代陆地微生物群的直接遗迹 [13]。这些情况提出了关于 CCM 在地球上出现的时间段和根源的问题。

目前，关于蓝藻中 CCM 出现的时间有几种理论，范围从 ~350 Myr（百万年）到 ~3.5 Gyr（十亿年）[2,14,15,16,17,18]。实验数据表明，甚至在~2 Gyr前大气气体成分发生根本变化之前，古老形式的CCM就可以在这些生物体中发挥作用[19]。这种原始 CCM 可以补偿由于各种原因在细胞周层中出现的不利的 [CO₂]/[O₂] 比率 [2,11,15,17]。Rubisco [20,21] 早期进化的缺失可能归因于古代蓝细菌中存在原始 CCM。

在微藻中，CCM 的外观很可能是独立的。微藻和蓝藻的 CCM 成分集的差异以及它们之间缺乏同源性都证明了这一点。有人认为，这一事件可能发生在大约 400-500 Myr 之前，在光呼吸出现之后 [22]。20-30 Myr [23\u201224] 之前陆生植物中 CO₂ 浓度替代策略（C₄ 和 CAM 光合作用）的发展被认为是由于无法使用“生物物理泵”将 C 从周围空气进入细胞的结果。

CCM 的高度生态意义支撑了人们对它的兴趣。地球上产生的氧气几乎有一半是由海洋浮游植物提供的，包括蓝藻和微藻，而另一半是由陆生植物提供的[25,26]。就其年总初级输出而言，海洋和陆地光合物种的 CO₂ 固定效果分布相似 （1：1） [25]。这一事实在当前的气候变化时期变得尤为重要，人类面临着保护生物圈生态、防止温室效应_和从大气中去除“过量”二氧化碳的任务。利用蓝藻和微藻的遗传潜力将人工CCM引入_C3植物以提高作物产量的想法也决定了多功能CCM研究的相关性[10,27,28,29,30]。

2. Rubisco，光合碳代谢的类型和 CO₂ 浓缩机制

自养生物中有机碳和无机碳循环的相互作用是通过 RPP 循环中的光合 C 固定发生的，Rubisco 是关键酶。Rubisco 的结构以及这些蛋白质的系统发育得到了相当充分的研究 [21,31,32,33]。所有 Rubisco 都分为四种基本形式 （I-IV），每种形式催化相同的反应，但具有非常不同的结构和动力学特性 [31]。Rubisco IV 是一个例外，它缺乏催化活性。为了区分后者与活性酶，属于 Rubisco IV 的蛋白质被称为 Rubisco 样蛋白质。假设 IV 型是固定 CO₂ 的 Rubisco 的祖先 [34]。

高等植物、蓝藻和真核藻类（以及变形菌门）的细胞携带Rubisco I型[31]。该组蛋白质由大 （L） （~55 kDa） 和小 （S） （~15 kDa） 亚基组成，形成 L₈S₈ 超结构。大亚基包含酶的活性中心，而小亚基似乎提供结构稳定性和催化效率 [32]。Rubisco 型 I 细分为四组 （IA-ID），由具有不同大亚基一级序列的酶组成。其中，IA和IB两种形式存在于变形菌门、蓝藻门、绿藻和高等植物中，而IC和ID存在于非绿藻门和变形菌门中[35]。

根据 CO₂ 固定的方式，区分出以下类型的光合碳代谢：C₃、C₄ 和 CAM。只有 C₃ 高等植物不需要添加 RPP 循环来保持高光合生产力。在这些生物体中，Rubisco 的周转率相当低 （k_cat^c），平均每秒进行约 3 次羧化反应 [21]。同时，这些酶的特征是对 CO₂ 作为底物的高亲和力 （平均 K_M （_{CO 2}）~14 μM） 和高 CO₂/O₂ 特异性 （平均 S_c/o~98）。此外，C₃高等植物叶绿体基质中Rubisco的含量比_CO2高出三个数量级，大约等于RuBP的含量，RuBP在体内提供了高浓度的酶活性位点，达到10 mM[36,37]。这些特殊特性使 C₃ 高级植物能够用 CO₂ 使羧化反应饱和。

与 C₃ 高等植物相比，蓝藻和微藻在当前大气 CO₂ 浓度下无法使 Rubisco 活性中心饱和。蓝藻 Rubisco 具有高羧化周转率（k_cat^c 高达 14 ^s-1），但对 CO₂ 作为底物的亲和力非常低（K_M （_{CO 2}） 超过 300 μM）和低 CO₂/O₂ 特异性 （avr.S_c/o~48），表明 CO₂ 作为底物比 O₂ 几乎没有优势 [21,38]。绿色微藻的 Rubisco 的特征是平均 S_c/o~62，对 CO₂ 的亲和力高于蓝藻 （avr.K_M （_{CO 2}）~32 μM），但羧化周转率较低 （avr. K_cat^C~3 s⁻¹） [21]。在微藻细胞中，Rubisco 平均占细胞总蛋白的 5% 左右。蓝藻Rubisco的含量很少超过10%，比_C3高等植物的光合组织低5倍[39,40,41]。

CAM 和 C₄ 植物的 Rubisco 通常具有与 C₃ 植物相似的动力学参数 [21]。然而，由于栖息地的特殊性和独特的生活策略，这些物种的_CO2水平（CAM）或过度的光呼吸（C₄）表现出显著的昼夜变化[23]。

因此，除 C₃ 高等植物外，所有光合自养生物都需要适应性机制来维持 RuBP 羧化反应的效率。这些生物体使用一种常见、最明显的策略——使用 Rubisco 活性中心附近的 CO₂ 分子浓度来使酶饱和。此策略可以通过三种不同的方式实现，下面将进一步讨论。

在高等陆生植物中，CO₂ 浓度是通过 C₄ 和 CAM 光合作用的操作实现的，这与 C₃ 光合作用的不同之处在于它们具有 RPP 循环的代谢附加功能，使 CO₂ 固定和还原的生化途径复杂化。这就是为什么这种类型的 CO₂ 固定被称为“生化”[3,18]。某些种类的淡水水生植物也属于CAM植物[23]。C₄ 和 CAM 光合作用中 CO₂ 的同化过程在许多方面都相似。在 C₄ 和 CAM 植物中，第一个 CO₂ 受体是磷酸烯醇式丙酮酸 （PEP），它与进入细胞的 CO₂ 分子水合产生的碳酸氢盐结合（图 1）。这里光合作用的主要产物是 C₄-二羧酸，随后的脱羧反应会形成 CO₂ 并将其掺入 RPP 循环（在 Rubisco 附近同时浓缩）。由于 C₄ 光合作用，Rubisco 定位位点的 CO₂ 浓度比大气水平增加约 10-20 倍 [42,43]，从而抑制光呼吸。然而，C₄植物对地球总光合作用的贡献很小，因为它们仅占所有已知物种的3%[44]。在生物化学和一般方案方面，CAM光合作用与C₄光合作用非常相似，但在_CO2净固定方面略逊一筹[45]。

图 1.（a） C₄ 植物细胞中暗相光合作用反应的示意图;（b） CAM 植物。缩写：C₃/C₄—C₃/C₄-二羧酸;OA—草酰乙酸;PEP—磷酸烯醇式丙酮酸;PEPC—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。

在具有 C₃ 型光合作用的微藻和蓝藻细胞中，CO₂ 浓度由 CCM 实现，这确保了外源性 C 的主动“泵送”到细胞中，随后 CO₂ 分子在羧化位点积累。CCM是在1980年代发现的[46,47,48,49,50,51,52]。其方案被称为“生物物理”类型的浓度[3,18,29,53]。与 C₄ 和 CAM 植物中起作用的 CO₂ 浓度的组成机制相反，CCM 是一个可诱导的过程，只有当环境中的 C 浓度降低时才会被激活。CCM 也是 RPP 循环的附加组件，不同之处在于细胞内的 C 池在 RPP 循环之前不会进入生化转化，并且第一个 CO₂ 受体是 RuBP。

适应大气 CO₂ 浓度的蓝藻和微藻细胞的特征在某些光合参数方面与 C₄ 植物相似（O₂ 对光合作用的抑制减少，光呼吸减少和 CO₂ 补偿点降低）。然而，在高 CO₂ 下生长的细胞显示出与 C₃ 植物相似的光合作用特性。与 C₄ 和 CAM 植物相比，CCM 可以在 RPP 循环中更有效地固定 CO₂ [30]。因此，微藻和蓝藻是地球总光合作用、有机物和氧气形成的重要贡献者[25,26]。

应该强调的是，目前的文献将 C₃ 高等植物称为具有所谓的“被动 CO₂ 浓缩机制”（pCCM）[54]。该术语是指不依赖 ATP 的生物运输过程，该过程确保捕获呼吸和光呼吸过程中释放的 CO₂，然后将其输送到 Rubisco 并重新固定。此外，有人提出，C₃高等植物的细胞可能采用“基础CCM”，这取决于线粒体CA的功能[55]。该方案还意味着防止 CO₂ 从电池中泄漏，并允许有效回收由于三羧酸 （TCA） 循环和光呼吸反应而释放的 CO₂。然而，上述两种方案不能被视为真正的 CO₂ 浓度，这意味着低浓度的外源性 CO₂ 在 Rubisco 活性中心附近转化为其高细胞内浓度的能量依赖性转化。相反，所谓的“基础”和“被动”CCM 与资源保护及其在细胞中的合理使用有关。

3. CCM 操作的一般原则

CCM 基于 C （HCO₃⁻/CO₂） 摄取系统和碳酸酐酶 （CA） 的合作。CCM 操作的简化方案如图 2 所示。第一步是创建 HCO₃⁻ 池，其细胞内含量可能比环境中的 C 浓度高几个数量级。在第二步中，使用储存的 HCO₃⁻ 在 Rubisco 的活性中心附近产生高浓度的 CO₂ 分子。

图 2.CCM 在微藻和蓝藻细胞中的示意图。字体大小反映了外部环境和细胞内 CO₂ 和 HCO₃⁻ 的相对浓度。粗箭头表示 C 流的主要方向。* 促进 CO₂ 吸收的能量需求目前仅批准用于蓝藻。

一般来说，蓝藻和微藻的 CCM 具有以下结构和生理特征：

• 
  CCM 组织在单个单元中;
• 
  CCM 是一个可诱导的过程：当外源性 C 的浓度不足以确保有效的光合作用时，它被激活;
• 
  CCM 感应需要光;
• 
  与高等植物的 C₄ 和 CAM 光合作用以及 C₃ 光合作用相比，C 仅通过 CO₂ 扩散进入细胞，微藻和蓝藻还具有 CO₂ 分子和 HCO₃⁻ 离子的主动（消耗能量）吸收系统;
• 
  在 CCM 运行期间，细胞内外 C 物质 （CO₂/HCO₃⁻） 的快速相互转化由 CA 维持;
• 
  CO₂ 的高效掺入 RPP 循环是通过 Rubisco 和 CA 在特殊微区室中的联合定位实现的，例如蓝藻中的羧基体或微藻中的类除虫。Rubisco 和 CA 之间的合作是 CCM 运作的根本基础;
• 
  CCM 包括防止 CO₂ 从电池中泄漏;
• 
  CCM 的结构特征允许保护 Rubisco 免受 O₂ 的影响并最大限度地减少加氧酶反应。

蓝藻和微藻中的 CCM 被称为“生物物理”CO₂ 浓度，因为它主要基于系统对外源性 C 的主动物理吸收的激活。同时，在 C 饥饿条件下的细胞在结构组织和生化过程中经历了相当复杂的重排 [6,22,56,57,58,59,60,61]。

应该强调的是，CCM 是一个严格依赖能量和光调节的过程，因为细胞对 C 的吸收和积累不会在黑暗中发生 [50]。除了细胞内碳的积累外，光还调节与CCM功能相关的许多其他过程，如CCM相关基因的转录、CCM成分与细胞的重新定位、羧基体和类除虫体的形成等[6,7,22,58,61,62,63]。目前尚不清楚 CCM 感应和操作的光调节是如何进行的。有人提出，在从光明到黑暗的转变下，根据[ATP]/[ATP + ADP + AMP]池比率的变化，可以对C摄取系统的活性进行变构调节[63]。

需要特别考虑 CCM 单元的能量消耗。C 限制条件导致生长速率显着降低，这很可能是由于 CCM 的高能量需求，这主要与诱导的 C 转运蛋白的运作有关 [6]。同时，CCM 通常是一种在能量上有利的光合作用同化模式。事实上，通过抑制光呼吸，CCM 有助于节省能源：CCM 功能的能量成本低于维持光呼吸代谢的能量成本 [64]。CCM 还减少了（与 C₃ 植物相比）确保给定的 CO₂ 固定速率所需的每单位生物质 Rubisco 的量。因此，用于 Rubisco 合成的细胞资源量同样减少 [64]。

此外，CCM 的功能有助于维持明暗光合反应之间的平衡。随着 C 饥饿的开始，RPP 循环的活性降低，导致可用的 NADP⁺ 和 ADP 分子减少。缺乏保持电子传递链运行所需的 NADP⁺，导致通过抑制光合装置的过度活动（光抑制）来抑制光过程。由于 ADP 分子短缺和 ATP 合酶活性降低，类囊体腔中质子过度积累也可能导致电子传递受到抑制。CCM 的激活导致 RPP 周期活性的恢复。同时，使用管腔质子将碳酸氢盐转化为_CO2 用于 Rubisco，最大限度地减少了它们的过度积累 [60,65,66,67]。因此，CCM 可以提高光利用效率，从而提高光合机制的整体效率 [64]。

3.1. C、C 摄取系统的外源来源和细胞内 HCO₃⁻ 池的形成

微藻和蓝藻生活在水生环境中，其中 C 以三种不同的形式存在：CO₂、HCO₃⁻ 或 CO₃²⁻，其比例取决于溶液的 pH 值 [68]（图 3）。pH值呈碱性的海水中含有大量的碳酸氢根离子（1.8 mM，90%）以及10%（0.35 mM）的_CO3^2和少量（0.01–0.02 mM）的溶解CO₂，与空气保持平衡[49,69]。海水中的 C 总浓度可达 2 mM。淡水仅含有 10 μM C，其可用形式以 CO₂ 和 HCO₃⁻ 表示。作为碳的外部来源，微藻和蓝藻使用 CO₂ 和/或 HCO₃⁻。许多微藻和蓝藻对某些形式的碳表现出物种特异性偏好[70]。外源性 C 的优先形式，以及特定于特定细胞的 C 摄取系统集，决定了对 CO₂ 或 HCO₃⁻ 摄取的偏好。

图 3.C 在水溶液中形成的浓度比和 pH 依赖性 [65];[CO₂]/[HCO₃⁻] 比值的 Henderson-Hasselbach 方程;以及 CA 确保的反应优先方向与 pH 值的函数关系。

外膜是外源性 C 的第一道屏障，外源性 C 可以通过水通道蛋白通道 [2,5]。然后 C 必须穿过质膜，在真核藻类中，必须穿过叶绿体膜。由于其在脂质中的高溶解度，CO₂ 分子可以通过直接扩散进入细胞。与 CO₂ 相比，带负电荷的 HCO₃⁻ 只能通过主动运输穿过细胞膜。同时，即使在存在浓度梯度的情况下，HCO₃⁻ 也能很好地保留在细胞中。微藻和蓝藻中碳酸氢盐吸收系统的存在至关重要，因为这些生物生活在 CO₂ 扩散速率远低于空气的水生环境中，而 HCO₃⁻ 经常成为外源性 C 的主要形式 [4]。

通常，三个通量可导致 C 的细胞内积累（图 2）：

• 
  HCO₃⁻ 主动转运到细胞中;
• 
  CO₂ 通过溶解气体的扩散进入池;
• 
  由于 CO₂（已经进入细胞）快速转化为 HCO₃⁻，因此 CO₂ 扩散到细胞中增加。

C 摄取系统的操作导致 C 作为 HCO₃⁻ 库的细胞内积累。细胞内区室中 CO₂ 向 HCO₃⁻ 的转化取决于它们的碱性 pH 值和基于 CA 活性的 C 转化系统的催化作用（第 3.2 节）。一般来说，CCM 积累的细胞内 C 浓度可能比环境中的 C 浓度高 10-1000 倍 [49,71]。

细胞对碳的主动摄取与浓度梯度相反是一个能量依赖性过程[5,64]。ATP 分子支持这种摄取，ATP 分子是在光合电子传递过程中产生的，包括循环和线性。当细胞适应低浓度的 CO₂ 时，循环电子传递活性增加，从而增加电子传递链产生的 ATP/NADPH 比率，并为 CCM 提供额外的 ATP 流入 [35,72]。在 C 限制条件下，微藻中光系统活性的比率 （PSI/PSII） 增加 [73\u201274]。在蓝细菌中，位于类囊体膜中并参与 PSI 周围循环电子传递的 NADPH 脱氢酶复合物的活性也有所增加 [35]。

3.2. 碳酸酐酶和 CO₂/HCO₃⁻ 转化系统作为 CCM 的一个元素

碳酸酐酶 （CA， EC 4.2.1.1） 系统由酶的外部和细胞内形式组成，是微藻和蓝藻 CCM 的第二个重要元素。由该酶催化的反应决定了 CA 参与生物过程：CO₂ + H₂O ⇆ HCO₃⁻ + H⁺。这种相互转换可以在没有 CA 的情况下进行，但速度非常慢。例如，CO₂ 水合自发反应的速率常数值为 0.037 s⁻¹ [75]，而 HCO₃⁻ 脱水的逆反应为 20 s⁻¹ [76]。这种情况可能会显着减慢生化过程。这就是为什么 CA 是如此重要的碳代谢酶，对碳基生命具有根本意义 [77]。CA 存在于所有目前已知的系统生物体群中;它们存在于所有器官、组织和隔室中，需要加速 CO₂/HCO₃⁻ 相互转化或四种反应组分中任何一种浓度的快速变化。关于生物体中CAs的催化机制、结构组织的多样性、系统发育和生物学功能的详细信息在几本书和文章中得到了适当的回顾[78,79,80,81]。

根据蛋白质的一级序列、其三维结构、活性位点组织和催化特性，所有已知的CA分为八类——α、β、γ、δ、ζ、η、θ和ι[79]。蓝藻和微藻拥有三类 CA——α、β 和 γ。除此之外，微藻细胞还含有 δ、 ζ 和 θ 类的 CA [82]。同一类别的 CA 可能由具有不同生物学相关性的几种蛋白质表示。CA 在蓝藻和微藻中最突出的生理作用与其细胞中 CCM 和光合作用的维持有关。这些酶在与这些整体机制相关的以下过程中参与或发挥关键作用：

• 
  通过提供 CO₂/HCO₃⁻ 分子进行跨细胞膜运输来摄取 C;
• 
  通过为 Rubisco 生成 CO₂ 底物进行光合 C 固定;
• 
  通过具有 CA 活性的细胞内 C 转化系统的操作防止 CO₂ 从细胞中泄漏;
• 
  通过保护微藻水氧化复合物 （WOC） 免受过量质子的影响，通过调节 PSII 活性和电子流速来调节光合作用。

CCM 有效运行的基本基础是在 CA 的参与下 C 物种的快速区室特异性转化。酶促反应中 CO₂ 和 HCO₃⁻ 的平衡浓度与溶液中 C 形式的分布相关，具体取决于其 pH 值，如 Henderson-Hasselbach 方程所示：pH = 6.3 + lg（[HCO₃⁻]/[CO₂]） [68]。因此，在 pH < 6.3 时，平衡向 CO₂ 的形成转变，而在 pH > 6.3 时，平衡向 HCO₃⁻ 的主要生成转变（图 3）。同样，特定 C 形式在特定细胞区室中的优势取决于其 pH 值。不同种类的微藻和蓝藻的细胞质pH值在7.1至8.2之间[5,83,84,85];叶绿体基质的pH值约为8 [85]。在这些隔室中，C 主要由碳酸氢盐代表（约 80-90%）。而在管腔中，当在被照亮的类囊体膜中产生质子梯度时，pH值达到4-5个单位[85]，CO₂成为C的主要形式。数学模型表明，蓝藻羧基体基质也具有酸性pH值[86]，酸性pH值可能是由于RuBP羧化反应过程中质子释放而形成的[87，88,89]。最近已证明羧基体内部内容物的 pH 值较低（与细胞质相比）[90]。

因此，C 从环境流向 Rubisco 的方向是由 CO₂ 和 HCO₃⁻ 的物理化学性质的差异以及细胞区室中 pH 值的差异和 C 在 CA 参与下的快速转化来保证的（图 2）。CAs 参与其摄取系统的 CO₂/HCO₃⁻ 递送是由周质或细胞周空间的局部 pH 值以及酶促反应中水合或脱水方向的优势介导的。细胞质和叶绿体基质的弱碱性 pH 值促进了 C 作为 HCO₃⁻ 的亲脂性中性库的优先积累。后者显着降低了 C 从细胞自发泄漏的风险。相反，在羧基体基质的酸性pH值或类梨类囊体内腔的酸性pH值下，CA从HCO₃⁻池中“释放”_CO2分子，供Rubisco使用[85,86,91,92]。在酸性管腔 pH 值下，碳酸氢盐脱水反应的优势使该酶在类囊体基质中去除 WOC 中的 H⁺ 具有保护活性 [92,93,94]。

细胞内 C 转化系统的操作，可能基于其 CA 活性，对于防止 CO₂ 分子泄漏到外部环境至关重要（第 4.2 节和第 5.3.4 节）。这些系统位于蓝藻的细胞质和微藻的叶绿体基质中，将 CO₂ 分子转化为 HCO₃⁻，促进 C 在细胞内的“锁定”。同时，C 转换系统捕获尚未纳入 RPP 循环的 CO₂ 分子。

3.3. 含 Rubisco 的微隔室：羧基体和类除虫。CA 和 Rubisco 之间的合作原则

上述 CCM 的所有阶段（在外部 CA 参与下的外源性 C 摄取，及其作为 HCO₃⁻ 在蓝藻细胞质中或微藻中叶绿体的细胞质和基质中的积累）是最后阶段的先决条件：将积累的 HCO₃⁻ 库转化为作为 Rubisco 底物的 CO₂ 分子。为了在 RPP 循环中有效地参与 CO₂ 并最大限度地减少这些分子从细胞中的泄漏，CO₂ 浓度仅在 Rubisco 活性中心附近局部增加（图 2）。细胞内 CA 负责将 HCO₃⁻ 转化为 CO₂。CCM的结构特征是CCM的一个结构特征，其中大部分Rubisco集中在微区室中，并且该酶与CA共定位于微区室[35,74,95,96]。在蓝藻中，这些微区室被称为羧基体，而在微藻中，它们被称为类核菌。类核糖体和羧基体内相的Rubisco含量达到其在细胞中总量的70-98%[57,97]。因此，Rubisco 和 CA 构成了 CCM 的核心要素，该机制“为了谁的利益”而运作。微藻和蓝藻中有机碳和无机碳循环的相互作用主要由这种串联介导。1989年首次提出了一种CCM模型，其中CA和Rubisco共定位于羧基小体[98]。

根据 C 的可用性，羧基体和类吡啶的大小、组成和结构都会发生显着变化。在低碳条件下，Pyrenoid结构变得更加明显，并且通常被厚厚的淀粉鞘包围[58,85\u201299]。在这些条件下，细胞Rubisco的大部分存在于类除虫中[61,99]。然而，在高 CO₂ 下，不到 50% 的酶出现在类除草体中，其余百分比与积累的淀粉粒一起存在于叶绿体基质中。在蓝细菌中，C 限制条件导致羧基体数量增加;由于蛋白质壳的合成，它们变得更加对比鲜明[57,100]。Rubisco 在 C 缺乏期间主要集中在羧基体中，很像类除虫。

新的类除虫体是通过裂变和从头组装形成的[101]。与羧基体相比，类吡嘧啶是一种瞬时亚细胞特征。CCM 存在于所有含有类焦烯的微藻中，但并非所有在低碳条件下积累 C 的微藻都含有类焦烯 [2]。因此，类蝶呤参与 CO₂ 浓度的微妙之处尚未得到评估。确定调节类吡啶组装和功能的因素是目前一个活跃的研究领域[102,103,104,105,106]。

 4. 蓝藻的 CCM

光合革兰氏阴性细菌，即蓝细菌，是我们星球上最古老的生物之一，也是唯一能够进行含氧光合作用的原核生物。由于 CCM，蓝藻具有极高的光合作用生产力。根据各种估计，这些生物贡献了全球净初级碳固定的10-30%[107,108,109]。

目前对蓝藻 CCM 的了解基于对模型实验室菌株的研究，例如淡水集胞藻属菌株 PCC 6803 和细长聚球藻 PCC 7942，或海洋集球藻属和原绿球菌属。CCM 功能的原则已在以前的许多综述中概述 [5,6,7,17,110]。在这里，我们将仅讨论该领域的最新进展，并回顾蓝藻 CCM 的诱导和功能的一般方案，同时考虑到其各个组件的工作原理。

4.1. 蓝细菌中的 CCM 诱导

如前所述，蓝藻 CCM 是一种可诱导机制，仅在外源性 C 不足以饱和光合作用的暗相时被激活。在蓝细菌中，别藻蓝蛋白可能起着C传感器的作用[111]。或者，这种作用被分配给可溶性腺苷酸环化酶，其活性与环境中的 C 浓度成正比 [112,113,114]。腺苷酸环化酶合成的 cAMP 可以作为 C 感应信号工作。

“低亲和力”（基础）和“高亲和力”（诱导）两种状态是蓝藻 CCM 的特征 [5,6]。CCM 的基础水平保持在以所谓的“高”C 水平生长的细胞中，并且能够在 RPP 循环中维持 RuBP 羧化反应的效率。在实验室中，这些条件对应于气体-空气混合物中 1.5–2% CO₂ 的培养物的生长。在这里，CCM 操作由其组成成分确保，其中包括低亲和力高速率 C 摄取系统（NDH-1₄ 和 BicA）、Rubisco 和羧基体 CA。在这些条件下，细胞内 C 的积累和 Rubisco 附近的 CO₂ 分子浓度不会发生。

CCM 的感应状态对应于 C 限制条件。这些通常是指在最自然的水生环境中生长，包括海水。高亲和力 C 摄取系统（NDH-1₃、SbtA 和 BCT1）主要负责诱导 CCM 的运作 [5]，确保细胞内 HCO₃⁻ 池的积累。此外，在这些条件下，类囊体 β-CA EcaB 水平升高 [115]。这种情况的发生可以通过 EcaB 参与 NDH-1₃ 复合物的运作来解释。

CCM 归纳需要优化其组件集和/或更改其活动。这由三个级别的调节过程来确保：（1） 转录，调节 CCM 成分的 mRNA 水平;（2） 转录后，调节 mRNA 的翻译效率;（3） 翻译后，通过修饰或变构调节来调节现有蛋白质成分的活性。

最近的综述分析了响应低 C 应激的最重要的生化变化 [6,7,116]。缺碳会抑制 RPP 循环并导致光合作用的明暗反应不平衡。光动力干扰导致细胞氧化还原状态的变化。蛋白质合成受到抑制。同时，由于 Rubisco 活性向氧合转变，光呼吸被激活。糖酵解、TCA 循环和氧化磷酸戊糖循环被激活，允许 NADPH 和 ATP 的额外合成，以及从有机化合物中释放碳以用于从头蛋白质合成。这些代谢途径中的中间体可以作为效应子，纠正 CCM 相关转录因子 （TF） 与 DNA 结合并控制基因表达的能力 [6,7]。这些具有已确定调节功能的代谢物包括 RuBP、2-磷酸乙醇酸盐 （2-PG） 和 α-酮戊二酸 （α-KG;也称为 2-氧代戊二酸）。此外，可以通过改变DNA拓扑结构来实现基因表达的调节[117,118]。

蓝藻细胞对低 C 的驯化受三种已知 TF 的控制 [6,7,116]：CmpR、NdhR （CcmR） 和 CyAbrB2。CmpR（cmp 操纵子调节因子）作为 cmp 操纵子的转录激活剂，编码淡水蓝细菌的高亲和力碳酸氢盐转运蛋白 BCT1 [119]。在 RuBP 和 2-PG 存在下，CmpR 与启动子的结合增强，预计在低 CO₂ 下其水平会增加 [120]。

另一种 TF，NdhR （CcmR）（NDH-1 基因调节因子/碳浓缩机制调节因子），作为基因的抑制因子，编码：（a） C 摄取系统 SbtA、BicA 和 NDH-1₃;（b） SbtB 调节蛋白;（c） 参与产生Na⁺依赖性HCO₃⁻摄取所需的电化学Na⁺梯度的复合物的mnH操纵子[121,122,123,124]。α-KG 分子充当共阻遏物并增强 NdhR 的启动子亲和力，而 2-PG 是 CCM 诱导剂 [125]。最初报道 NADP⁺ 也可以作为 NdhR 的共阻遏因子 [126]，但进一步的研究尚未证实这一事实 [125]。α-KG 的浓度与电池的碳/氮平衡有关。由于活跃的TCA循环和氮的限制，这些分子在C过量下积累[116,127,128]。同时，Rubisco 氧合反应产生的 2-PG 分子作为 C 缺乏的信号。当 2-PG 出现时，它会拮抗 α-KG 的作用，导致 NdhR 从其靶标抑制位点解离 [125]。

第三种TF是cyAbrB2（蓝藻AbrB样蛋白2），通过控制编码BCT1、NDH-1₃和SbtA/B的几个CCM相关基因，与CmpR和NdhR互补[129,130]。调节该 TF 的效应子目前尚不清楚。

在转录后水平，CCM 成分组成的变化受到小调节 RNA 的翻译调节 [131]，这有助于增强或减弱某些蛋白质的合成。小 RNA 可能控制 C 缺乏症下羧基体数量的增加，因为在这些条件下 ccm 基因簇的表达没有上调 [6]。

在翻译后水平，由于细胞氧化还原状态的变化 [7]、磷酸化 [132] 或蛋白质的其他结构修饰，硫醇基团状态的变化可能起作用。一个重要的调控元件是 SbtB 蛋白，它是多功能信号处理蛋白 PII 超家族的成员 [133,134]。以前，SbtB 仅被视为一种调节因子，它变构控制 HCO₃⁻ 转运蛋白 SbtA 的转运活性 [63,116,135,136]。SbtB 与各种腺苷酸核苷酸的结合，包括 cAMP——一种参与 C 驯化的潜在信号分子 [113,114]，表明它参与 CCM 活性的调节 [133]。最近有报道称，SbtB 参与调节许多 CCM 相关基因的表达（无论二级信使是否参与）[137]。该法规的机制仍有待评估。

4.2. 蓝细菌中的 C 摄取和细胞质中的 C 转化系统

在蓝藻模型菌株中，已知有 5 种允许 C 进入细胞的系统 [7,138]。其中包括 3 个 HCO₃⁻ 转运蛋白和 2 个 CO₂ 摄取系统。后者由于 CO 2 快速转化为 HCO₃⁻ 并产生负梯度，确保 CO₂ 在细胞内的扩散（图 4）。支持蓝藻中 C 转运系统的辅助元件（图 4）是：（1） Na ⁺ / H ⁺ 逆向转运蛋白 NhaS3 和 （2） 专门的 NDH-1 复合物 Mnh;两者都参与碳酸氢盐依赖性转运过程中 Na ⁺ 梯度的产生;以及 （3） 质子泵 PcxA，其作用是从细胞质中释放 H⁺，并有助于将细胞 pH 值维持在弱碱性值，从而确保细胞内 C 以 HCO₃⁻ 的形式积累。

图 4.蓝藻模型菌株中的 CCM。还显示了周质 CA 、 EcaA 和 EcaB，但它们参与 CCM 尚未得到证实。缩写： OM—外膜;PM—质膜;TM - 类囊体膜。

碳酸氢盐转运蛋白由位于质膜中的蛋白 SbtA、BicA 和 BCT1 复合物代表 [138]。值得注意的是，蓝细菌缺乏负责许多原核生物（包括化学自养生物）摄取碳的DAB复合物[139,140]。活性 HCO₃⁻ 摄取的能量当量是 ATP 分子（BCT1 操作所需）或实现 SbtA 和 BicA 操作的 Na⁺ 电化学梯度 [7]。

具有中等通量速率的高亲和力 （K_M （_{HCO 3}⁻）~15 μM） 转运蛋白 BCT1 （碳酸氢盐转运蛋白 1） 由 cmpABCD 操纵子编码 [141]。BCT1 仅在严格的 C 限制条件下表达 [100,142,143]。在栖息在HCO₃⁻浓度高的环境中的海洋和嗜碱物种中，这种高亲和力转运蛋白很少被检测到[5,12,144]。

SbtA（碳酸氢钠转运 A）是一种可诱导的、高亲和力 （K_M （_{HCO 3}⁻）~5 μM） Na⁺ 依赖性转运蛋白，通量速率相对较低 [145]。蓝细菌基因组可能包含具有不同同源性的 sbtA 基因的多个拷贝。SbtA 转运活性受 PII 样信号转导蛋白 SbtB 的变构调节，该蛋白可以结合许多腺苷基核苷酸 [63,133]。两个相应的基因 sbtA 和 sbtB 通常在单个操纵子中相邻，并在 C 限制条件下一起表达 [133]。SbtB 与 SbtA 的结合抑制了 SbtA 的碳酸氢盐摄取功能 [135]。SbtA/SbtB 复合物的形成和解离取决于 SbtB 结合的腺苷酰核苷酸的性质。关于 SbtB 调节 SbtA 活性的性质有两种不同的看法。其中一项研究[116,136]表明，SbtB充当C传感器，分别区分低C和高C下的[ADP + AMP]和[cAMP]浓度差异。第二个模型[63]意味着SbtB在从明到暗的转变中，通过改变细胞中的腺苷酸电荷比（[ATP]/[ATP + ADP + AMP]）对SbtA进行光依赖性调节。

第三种HCO₃⁻转运蛋白BicA（碳酸氢盐转运蛋白A）具有低亲和力（K_M （_{HCO 3}⁻） 90–170 μM）的特征，并支持高通量速率[146]。在不同种类的蓝细菌中，BicA 可以在 C 限制下组成型表达或高度诱导 [100,123,146,147]。通常，与 SbtA 类似，细胞包含几种具有不同同源性的 BicA 蛋白。值得注意的是，BicA 是通常在海洋蓝藻中检测到的唯一 C 转运系统 [5]。

NDH-1₃ （NDH1-MS） 和 NDH-1₄ （NDH1-MS' 这两个系统是真细菌和真核线粒体中 NADPH 脱氢酶呼吸复合物 （NDH-1） 的特殊修饰 [148]。NDH-1_3/4负责蓝藻对_CO2的摄取[149,150]。与线粒体复合物相比，线粒体复合物在 NADPH 氧化的同时产生用于 ATP 合成的 H ⁺ 梯度，NDH-1_3/4 使用还原的铁氧还蛋白作为能量当量。在这方面，蓝藻的“NDH-1”名称最近已更改为“光合复合物I”[151]。

在微藻中，NDH-1₃ 和 NDH-1₄ 复合物都位于类囊体膜中 [152,153]。低亲和力 （K_M （_{CO 2}）~10 μM） NDH-1₄ 是组成型表达的，而高亲和力 （K_M （_{CO 2}）~1–2 μM） NDH-1₃ 是由 C 限制诱导的 [5]。据认为，NDH-1_3/4将进入细胞的_CO2转化为HCO₃⁻是由于其独特的（与蓝细菌中的其他NDH-1复合物相比）组成蛋白CupA/B的CA活性，也称为ChpY/X [149,150,154]。尽管 CupA/B 的 CA 特异性活性尚未通过实验得到证实，但这一假设得到了计算机模拟以及大量间接数据的充分支持[154,155,156,157]。关于 NDH-1_3/4 复合物的功能，已经提出了两种替代假设。它们的根本区别在于假设 CO₂ 底物是否供应给 CupA/B 活性中心：（a） 从细胞质 [115] 或 （b） 从类囊体腔 [158]。也有人提出，NDH-1_3/4 的 CA 活性可能由 β-CA 和 EcaB 维持或调节，其特异性活性和与 CupA/B 蛋白的相互作用已得到证实 [115]。

除了 CO₂ 吸收外，NDH-1_3/4 复合物还充当 C 转换系统，并防止从羧基体逸出的 CO₂ 分子泄漏（图 4）。在高光胁迫下，NDH-1_3/4 可以通过缓解质体醌池的过度还原和防止光抑制来参与过量的 HCO₃⁻ 和光能的消散 [115]。这种碳回流到环境中，通过ATP分子或其等效物（质子梯度）的快速循环来耗散多余光能的现象在大约25年前[159,160]首次被描述，并被命名为“碳循环”。此外，NDH-1_3/4 配合物参与围绕 PSI 的电子流循环 [156,161]。

4.3. 蓝藻碳酸酐酶

蓝细菌细胞包含外部（位于相对于质膜的外层）、类囊体和羧体形式的 CA。但是，并非所有 CCM 都参与其中。

EcaA （外部碳酸酐酶，α 类） 蛋白具有通过质膜运输的前导序列，是蓝细菌中唯一的 α 类 CA。在许多蓝细菌的基因组中发现了ecaA基因，但仅在两个物种中证实了EcaA的存在，即鱼腥菁属PCC 7120 [162]和蓝藻属ATCC 51142 [147]。早期的研究还报道了Synechococcus elongatus PCC 7942中存在EcaA [162]。该结论基于对 Synechococcus 总蛋白与 Anabaena 的 EcaA 抗体的 Western blot 分析。然而，无论 C 供应如何，特异性抗体都无法在聚球球菌细胞中定位 EcaA [163]。

EcaB 蛋白（外部碳酸酐酶，β 类）以前也被称为外部 CA，因为它存在一个假设的脂蛋白脂质附着位点 [164] 和一个通过质膜转运的前导序列 [165]。尽管先前蛋白质组学方法直接证实了 PCC 6803 集胞藻 PCC 6803 周质间隙中存在 EcaB [165]，但最近的一项研究表明，这种蛋白质的大部分与类囊体膜有关，只有一小部分与质膜有关[115]。

EcaA 和 EcaB 的特异性活性直到最近才得到证实 [115,147,163]，距离这些蛋白质被发现已经过去了 20 多年。EcaA 的生理作用以及周质 EcaB 的生理作用尚未确定。EcaB 类囊体形式的生物学作用可能与 NDH-1_3/4 系统的功能有关，该系统负责细胞质中 CO₂ 的摄取和 C 的转化 [115]。

文献中提到的另一种外部β-CA是来自嗜盐碱蓝细菌Sodalinema gerasimenkoae IPPAS B-353（以前称为Microcoleus chthonoplastes）的CahB1蛋白（碳酸酐酶，β类，蛋白1），它出现在细胞包膜和胞外多糖层中[166,167]。虽然 CahB1 与羧体 β-CA、CcaA 具有极高的同源性，但尚未证实 CahB1 存在于 S. gerasimenkoae 羧基体中。CahB1 不包含任何用于通过质膜运输的经典前导肽这一事实加剧了这一悖论。此外，CahB1 似乎是 IPPAS B-353 菌株中唯一活跃的 CA [144]。如果是这样，关于在 S. gerasimenkoae 羧基体中将 CO₂ 输送到 Rubisco 的 CA 的问题仍然悬而未决。值得注意的是，当在集胞藻属 PCC 6803 中异源表达时，CahB1 充当功能性羧基体 CA [168]。从理论上讲，总体数据 [144,166,168] 可以用来自不同栖息地的蓝藻中 CAs 系统结构的潜在变化来解释。与“模型”菌株相比，“非模型”菌株，包括 S. gerasimenkoae，可能表现出不同的 CA 参与光合碳代谢的模式。同时，S. gerasimenkoae 属于一组所谓的“孑遗”蓝藻 [11,13]。因此，这些细胞有可能保留了古代原始分泌系统的变体[168]。

蓝藻的羧体 CA 由以下酶表示：β-CA CcaA（羧体碳酸酐酶蛋白 A），以前称为 IcfA（无机碳固定蛋白 A）;β-CA CsoSCA （羧基体壳碳酸酐酶），以前称为 CsoS3 （羧基体壳蛋白 3）;以及γ类CA，CcmM（碳浓缩机制，蛋白M）[169,170,171,172]。这些 CA 的作用是将 HCO₃⁻ 转化为 CO₂，以便 Rubisco 进一步固定并参与 RPP 循环。

 4.4. 羧基小体

蓝藻中含有 Rubisco 的微区室称为羧基体。羧基体是多面体蛋白质微抗体，直径通常为100-400 nm，位于细胞质中，并被单层蛋白质外壳覆盖[173,174,175,176,177,178]。在透射电子显微镜图像上，羧质体在细胞质中表现为多面体电子致密的内含物（图 5a）。羧基小体的存在也是许多自养细菌的一个特征[177]。

图 5.蓝藻羧基体。（a） 蓝藻集胞藻属菌株 PCC 6803 细胞质中的羧基小体（箭头）。图片由 M.A. Sinetova 博士（KA Timiryazev 植物生理学研究所，RAS，莫斯科）友情提供。比例尺为 0.5 μm。（b） 海原绿球菌 MED4（α-蓝细菌）和细长聚球藻 PCC 7942（β-蓝细菌）中 α-和 β-羧基体的结构成分。修改自 [174];补充自 [89,175]。β-羧基体壳内层的蛋白质形成碳酸氢盐脱水复合物，在RPP循环中将HCO₃⁻转化为CO₂[184]。该复合物的组织链接是 CcmM 蛋白的全长形式，可同时结合 Rubisco、CcmN 和 CcaA （β-CA）。该复合物通过 CcmM 与外壳层 CcmK 和 CcmL 中的蛋白质的特异性相互作用与羧基体壳相关联。碳酸氢盐脱水由 CcaA 或 CcmM CAs 进行。

羧基小体可能包含两个Rubisco亚类，IA和IB，根据这两个亚类，它们被称为α-或β-羧基小体，含有它们的生物体被称为α-和β-蓝细菌[174,175]。这两种类型的羧基体是结构和功能类似物，由同源蛋白质和酶组成。此外，α型和β型羧基体在基因组水平上的组织不同。α-羧基体中包含的编码多肽的基因通常组织在单个 cso 操纵子中，而 β 型羧基体组分的基因聚集在多个基因组位置 [174,175]。β-羧基体基因的聚集意味着它们响应环境变化的独立调节和表达可塑性[177]。

最近的研究表明，α-羧基体和β-羧基体是趋同进化的结果[179]。人们对每种类型的微抗体的潜在生态效益知之甚少。直到最近，人们还认为具有 Rubisco 型 IA 的蓝藻主要栖息在海水中，而大多数具有 Rubisco 型 IB 的蓝藻更喜欢淡水环境。然而，最近的研究对这种范式提出了挑战[180]。

两种类型的羧基体都由基质和蛋白质壳组成（图 5b）。该基质包括支持酶三维组织的 Rubisco 和结构蛋白（分别在 α 和 β-羧基体中为 CsoS2 或 CcmM）。羧基体壳的结构单元是几种类型的同源寡聚蛋白，它们形成带有孔隙的壳顶点或壳面，代谢物分子可以通过这些孔。研究表明，这些孔促进了 HCO₃⁻ 和 RuBP 选择性进入该微区室，并同时将 3-磷酸甘油酸 （3-PGA） 释放到细胞质中 [181]。分子模拟表明，羧基体壳起到 CO₂ 和 O₂ 的屏障作用 [182,183]。它阻止 CO₂ 从基质中泄漏，同时阻止 O₂ 进入，从而将 Rubisco 的羧化酶活性保持在高水平。

羧体 β-CAs、CsoSCA 和 CcaA 是功能类似物。CsoSCA 与 α-羧体壳的内侧结合，可能独立于其他蛋白质成分进行 HCO₃⁻ 到 CO₂ 的转化 [171]。与 CsoSCA 不同，CcaA 是位于 β-羧体壳内层的所谓“碳酸氢盐脱水复合物”的一部分 [184]。β-羧基体的另一种重要蛋白质是 CcmM。CcmM 以两种形式表达 [185]。全长形式由一个 N 末端 γ-CA 结构域组成，后跟几个由连接子连接的 RbcS 样结构域。CcmM 的简称仅包含 RbcS 样结构域。全长 CcmM 是碳酸氢盐脱水复合物的一部分，在没有 ccaA 基因的情况下，它也可以发挥 CA 的作用 [186,187]。CcmM 的简称是负责 Rubisco IB 旁晶组织的结构元件 [174,188]。最近，除了短形式外，在羧基体基质中还显示了全长 CcmM 的存在，它可能也可以参与 Rubisco 的三维组织 [189]。

蓝藻羧基体的另一个成分是 Rubisco 活化酶。在α-羧基体中，该成分以 CbbX 蛋白表示 [190]。β蓝细菌细胞中可含有ALC（活化酶样蓝藻蛋白），ALC不作为经典的Rubisco活化酶发挥作用，但它的存在对于羧基体的正确组装很重要[191]。

细胞中羧基体分布的缺陷导致其伸长、不对称分裂、Rubisco 水平升高和生长迟缓 [192]。这些观察结果表明，羧基体不仅可以作为 CO₂ 固定中心，还可以参与其他生理过程。β蓝细菌中羧基体的空间分布是通过双组分系统McdAB的操作实现的，该系统可能采用布朗棘轮机制来定位这些微抗体[193,194]。在α蓝细菌中也发现了类似McdAB的系统[195]。

羧基体的结构组织根据细胞的 C 供应水平发生显着变化。在 C 过量的情况下，在 β-蓝细菌的细胞质中发现了前羧基体。它们代表与CcmM组装在一起的Rubisco和CA聚集体[196,197,198]。当环境中的 C 减少时，这些砾岩被蛋白质壳包被并转化为羧基体。获得具有选择性特性的壳使这些微粒成为 CCM 的成熟参与者。

4.5. 蓝藻 CCM 模型

蓝藻中 CCM 操作的一般方案如图 4 所示。当 CCM 进入高亲和力状态时，细胞的活性 C 积累始于三个 HCO₃⁻ 转运蛋白（BCT1、SbtA 和 BicA）和两个 CO₂ 摄取系统（NDH-1₃ 和 NDH-1₄）（第 4.2 节）。C-摄取复合物的结构受每种特定蓝藻物种的栖息地的显着影响。它的组成，以及 C 吸收系统与其底物的亲和力，以及它们的内禀通量率，严格符合物种的需求，以确保 C 的流入足以使光合作用饱和。

无论外源性底物的类型如何，C 进入细胞后都会以 HCO₃⁻ 库的形式积累在细胞质中，微碱性 pH 值约为 7.4，这显着降低了 CO₂ 自发泄漏的风险。在碳限制下生长的细胞质中HCO₃⁻的浓度达到20-40 mM [71,74,199,200]。

蓝藻中 CO₂ 浓度的最后阶段在羧基体中进行。HCO₃⁻ 和 RuBP 通过壳蛋白形成的孔进入该微区室 [181]。在羧基体基质的酸性pH值（<6.3）下，在羧基体CA（CsoSCA、CcaA或CcmM）的参与下，将积累的HCO₃⁻转化为CO₂分子（4.3节）[86]。Rubisco 使用产生的 CO₂ 对 RuBP 进行羧化。合成的 3-PGA 从羧基体回流到细胞质，其余的 RPP 循环反应在那里发生。Rubisco 和 CA 在羧基体中的共定位显着减少了 CO₂ 分子的泄漏。由于羧基体蛋白质外壳的选择性，在减少光呼吸的同时实现了 CO₂ 泄漏的额外最小化。从羧基体泄漏的有限量的 CO₂ 被 NDH-1 3/4 复合物转化为 HCO₃⁻，NDH-1_3/4 复合物充当细胞内 C 转化系统，同时参与 CO₂ 摄取（第 4.2 节）。通过 NDH-1_3/4 的工作，CO₂ 分子返回到 C 的总细胞质库中。

5. 莱茵衣藻 CCM

由于真核细胞中亚细胞区室的数量较多，微藻的 CCM 比蓝藻的 CCM 更复杂。它的结构和功能原理在单细胞绿色微藻 Chlamydomonas reinhardtii 的模型实验室菌株中得到了最好的研究。在外源性 CO₂ 的有限浓度下，细胞内 C 积累的影响也首先在 C. reinhardtii 中被发现 [46]。其他真核微藻的 CCM 组织研究得更少。现有信息主要涉及可能涉及 C 浓度的单个组分或该过程的某些特定方面。一个值得注意的例外是海洋硅藻，其 CCM 结构和功能是使用全基因组序列重建的;它似乎与C. reinhardtii的CCM非常相似[53]。

莱茵梭菌的CCM至少需要17个组成部分才能正常工作[9,28,201,202]。其中包括 9 个跨细胞膜 C 转运系统（HLA3、LCI1、LCIA、CCP1、CCP2、CIA8 和 BST1-3）;3 个 CA （CAH1 、 CAH3 和 CAH6）;两种外周类吡啶蛋白（LCIB 和 LCIC），可能也具有 CA 活性;甲基转移酶同系物蛋白 CIA6;和两个核转录调节因子 （CIA5 和 LCR1）。这些个体参与者的确切功能和重要性仍未完全了解。以下五种蛋白证明了提供从外部环境到 Rubisco 的定向 C 流的明确必要性：HLA3、LCI1、LCIA、CAH3 和 LCIB。

5.1. CCM： 低 C 下莱茵梭菌的诱导和两种光合驯化态_i

在莱茵梭菌中，细胞在适应环境中各种 CO₂ 浓度的过程中区分了三种生理状态 [9,10]：

• 
  L 细胞（低 CO₂ 细胞）适应低 CO₂ （0.04-0.5%）。总计 0.04% 对应于现代大气中 CO₂ 的天然含量。
• 
  VL 细胞 （极低 CO₂ 细胞） 适应非常低 （<0.02%） 的 CO₂ 浓度。
• 
  H 细胞（高 CO₂ 细胞）适应了升高的 CO₂ 浓度 （2-5%）。

不同的 CCM 组分负责 L 细胞和 VL 细胞的适应，导致它们不同的光合作用和生理特性 [9]。它主要涉及对 CO₂ 具有较高亲和力且光合活性同时降低的 VL 细胞。与 L 细胞相比，VL 细胞的特点是体积小、生长速度慢和叶绿素含量低。尽管生理特性存在差异，但 L 细胞和 VL 细胞在 CCM 相关基因的转录水平上没有差异 [203]，这表明存在一些调节驯化的非转录开关。

与蓝藻相比，支持微藻 CCM 激活和过渡到高亲和力状态的机制的研究明显较少。迄今为止，很明显，莱茵梭菌的CCM活性不仅仅取决于外部环境中的_CO2含量[22]。与蓝藻（第 4.1 节）一样，假设微藻细胞通过间接信号感知 CO₂ 的减少，其出现与光合作用的亮相（光合电子传递）和暗相（RPP 循环）之间的不平衡有关。这些信号包括光呼吸代谢物或细胞氧化还原状态的变化。它们通过特定的介质（如 CAS 或 GUN4）参与逆行信号传导，并作为 CCM 诱导的效应子 [22]。

编码已确认的 CCM 成分的大多数基因在 CO₂ 升高下实际上没有转录，仅在 C 限制条件下显示表达水平增加。例外是 CAH3 和 LCIB，它们在高 CO₂ 下分别显示低表达和中等表达，在碳限制下 mRNA 水平增加很少或很高（[203]，补充数据;[204]，补充数据）。这可能表明相应的蛋白质，类囊体 CA CAH3 和 LCIB 蛋白，它是叶绿体基质中 C 转换系统的一部分，是莱茵梭菌在广泛的外源性 C 浓度下成功生长所必需的。

只有通过转录组学方法的发展才能获得莱茵梭菌细胞对 C 限制反应的最完整图片。一项综合分析[203,204]显示，在适应新环境开始时，光合作用总体减少，蛋白质合成和细胞能量水平降低，同时光呼吸增加。在短时间 （~30 min） 后观察到编码 CCM 成分的基因表达的诱导。

CIA5 （也称为 CCM1） 和 LCR1 是在莱茵梭菌中鉴定的两种 CCM 相关调节蛋白。目前尚不清楚可能参与 CCM 活性转录调控的其他潜在调节元件的活性 [22]。CIA5（C 积累蛋白 5）是 CCM 表达的主要调节因子 [205,206,207,208]。CIA5 控制 CCM 的所有已确认成分（表 1 和 表 2），以及第二种调节蛋白 LCR1（低 CO₂ 应激反应）[209]。因此，LCR1 调节的基因最终受 CIA5 控制。CIA5 是组成型表达的，与外源 CO₂ 浓度无关，它需要在 C 限制条件下进行翻译后激活 [206,207,208]。CIA5 可以起 TF 的作用，也可以通过修饰其他调节蛋白或与其他调节蛋白相互作用来发挥调节功能 [9,22]。LCR1 作为传统的 TF [209] 在 CIA5 的参与下激活转录。

表 1.C. reinhardtii 中已确认和潜在的 C 运输系统。

表 2.碳酸酐酶和 C 转化系统在 C. reinhardtii 中具有推定的 CA 活性。

在转录后水平，莱茵梭菌中 CCM 活性的调节是通过小调节 RNA [22] 或翻译后修饰 [9] 改变翻译效率来实现的。磷酸化在藻类 CCM 组分激活中的作用已得到充分证实。磷酸化会影响 CCM 组分及其直接蛋白质环境。接头蛋白 EPYC1 （LCI5） 的磷酸化对类核糖苷组装至关重要，通过改变蛋白质结合结构域的可用性来调节其与 Rubisco 的相互作用 [102,210]。管腔 CAH3 的磷酸化导致其 CA 活性显著增加，并从基质类囊体迁移到类除虫小管 [67]。在极低的_CO2下，LCIB/LCIC复合物（一种基质C转化系统）向类辉体扩散[211,212]显然也与其蛋白质成分的磷酸化有关[213]。对莱茵梭菌磷酸化蛋白质组的整体分析显示，许多其他 CCM 相关蛋白，如 HLA3、LCIC 和几种 CA（CAH6-9 和 CAG2）被磷酸化 [214]。翻译后修饰的另一种方式是谷胱甘肽化，这已经被证明用于 LCIB 和参与 RPP 循环的蛋白质 [215]。这可能表明 CCM 调节中 C 饥饿条件下细胞氧化还原状态的变化和氧化应激作用。

5.2. C 在 C. reinhardtii 中的运输

微藻和蓝藻一样，同时使用来自水性环境的 CO₂ 分子和碳酸氢根离子。在前往 Rubisco 的途中，C 必须克服质膜、叶绿体包膜和类囊体膜。C. reinhardtii 细胞具有多种经实验验证和潜在的跨膜 C 转运系统（表 1）。直到最近，MITC11（线粒体载体蛋白）是线粒体载体蛋白的同源物，也被认为是莱茵梭菌叶绿体中潜在的 C 转运蛋白 [8]。然而，迄今为止，MITC11 的这一作用既未得到证实，也未被反驳。由 ycf10 基因 [216] 编码的叶绿体包膜蛋白 CemA 也被排除在潜在的 C 转运蛋白列表中。现在假设 CemA 作为 Na⁺ 依赖性质子泵工作，可从基质中去除 H⁺ [9]。

值得注意的是，许多参与 C 摄取系统功能（HLA3、LCI1、LCIA、CCP1/2 和 BST1-3）的莱茵梭菌基因的转录在 CO₂ 降低时增强。这些基因直接或通过 LCR1 受 CIA5 控制，CIA5 是 CCM 基因表达的主要调节因子 [202,203,217]（表 1）。HLA3、LCI1 和 LCIA 蛋白参与 CCM 相关 C 摄取现已得到相当充分的证实。CIA8 和 BST1-3 基因表达的缺陷会减少细胞的生长，并在 CO₂ 限制下导致它们对 C 的亲和力降低 [201,202]。然而，CIA8 和 BST1-3 作为 HCO₃⁻ 转运蛋白的活性仍然需要实验确认。在潜在转运蛋白 CCP1 和 CCP2 的帮助下，C 蛋白跨线粒体膜的转运被认为在 CCM 与光呼吸的协调中很重要 [10,22]。

5.2.1. C 通过质膜的转运

C. reinhardtii 有几种蛋白质已被证明或被怀疑参与通过细胞第一道屏障（质膜）的 C 运输。

HLA3（高光激活蛋白）属于具有ATP结合盒的ABC转运蛋白家族[208,218,219]。HLA3 最初被描述为由高光强度诱导的基因。HLA3 在质膜中的位置有据可查 [28]。有几篇著作专门阐明了它的功能 [220,221,222]。HLA3 转运 HCO₃⁻ 的能力已在非洲爪蟾卵母细胞模型系统中的体外明确证明 [28]。HLA3 对 VL 细胞的驯化很重要，并且被 L 细胞中低 CO₂ 抑制 [223]。在低 CO₂ 下，HLA3 基因的转录增强是通过参与 Ca²⁺ 依赖性逆行信号传导的 CAS（钙感应）蛋白发生的 [224,225]。最近，SAGA1蛋白的功能以前仅归因于淀粉鞘的形成和类焦烯结构的维持[104]，被证明在此过程中起着重要作用[106]。

LCI1（低 CO₂ 诱导蛋白）最初被发现是一种质膜蛋白，仅在_CO2 浓度降低时表达 [226,227]。LCI1 确保 L 细胞中 CO₂ 的活性摄取，而它在 VL 细胞中的作用很小 [228]。LCI1 的结构研究表明，它可能起到门控质膜 CO₂ 通道的作用 [229]。

在莱茵梭菌的质膜中，HLA3 和 LCI1 形成与其他几种蛋白质相互作用的关节复合物 [102,222]。特别是，HLA3 和 LCI1 都与 ACA4 相互作用，ACA4 是一种推定的 H⁺ 输出 ATP 酶。研究表明，ACA4 可能通过维持质子梯度或产生局部胞质碱性区域来促进 HCO₃⁻ 的摄取 [102]。

在莱茵克罗犬的质膜中发现了两种恒河猴样蛋白，RHP1和RHP2，被认为是潜在的_CO2通道[230,231,232]。可用信息主要归因于 RHP1。RHP1基因表达的增强和相应蛋白质在细胞中的出现仅在高CO₂时发生[203,233]。早期的研究[217]假设RHP1的表达不受CIA5的控制。然而，其他研究表明 CIA5 参与了 RHP1 的调节 [203]。虽然 RHP1 和 RHP2 不直接被 CCM 指定，但在 CO₂ 浓度升高的情况下，它们可能对衣藻的生命活性很重要 [233]。

5.2.2. C 通过叶绿体包膜的运输

C. reinhardtii 的叶绿体包膜形成了 C 向 Rubisco 运输的第二个障碍。甚至最近，已经考虑了三种可能与 HCO₃⁻ 转运到叶绿体相关的候选蛋白：LCIA 蛋白和 CCP1/CCP2 蛋白 [9]。最后，CCP1/CCP2 被分配给线粒体 [28]，尽管它们仍然保留了以前的首字母缩略词（CCP，叶绿体载体蛋白）。

LCIA（低CO₂诱导型蛋白A）最初被注释为推定的亚硝酸盐转运蛋白，因为它的结构与甲酸盐/亚硝酸盐转运蛋白（FNT）相似[208,234]。这就是为什么 LCIA 经常以另一个名称 NAR1.2 （亚硝酸盐同化相关） 出现的原因。LCIA 同化 HCO₃⁻ 和 NO₂⁻ 的能力已得到证实 [28,234]。与其他细菌性FNT一样，LCIA被认为通过与质膜蛋白HLA3合作，起到促进HCO₃⁻进入叶绿体的通道的作用[28,102,220,222]。

研究表明，LCIA 在 VL 细胞 （0.01% CO₂） 中具有生理相关性，并且受到环境 CO₂ （0.04–0.5%） 水平的抑制 [204,223]。LCIA 基因转录的激活以及 HLA3 的转录发生在 C 缺乏的情况下，由 CAS 蛋白介导 [224]。

尚未报道叶绿体包膜中存在专门的 CO₂ 转运蛋白。因此，由 LCI1 转运到胞质溶胶中的 CO₂ 分子可能通过不明转运蛋白或被动扩散进一步进入叶绿体基质 [228]。

5.2.3. 类囊体膜中的碳酸氢盐转运蛋白

长期以来，莱茵梭菌光合 C 同化方案中的主要缺失环节之一是从叶绿体基质到类囊体腔的 HCO₃⁻ 转运蛋白，它为 CAH3 提供碳酸氢根离子。这种转运蛋白的存在是批准 CAH3 参与向 Rubisco 供应 CO₂ 以及 WOC 稳定化的关键论据 [65,87,93]。因此，最近发现的这些 CCM 组件成为人们热切期待的事件。

CIA8 （C 积累蛋白 8） 基因编码属于钠/胆汁酸同向转运蛋白 （SBF） 的跨膜蛋白，该蛋白也可能参与碳酸氢盐转运 [201]。CIA8 蛋白具有一种前导肽，可以将该蛋白靶向类囊体膜或叶绿体包膜。CIA8 在莱茵梭菌细胞中以 GFP 融合的形式表达，与叶绿体包膜无关，而是分散在整个细胞器中 [201]，表明 CIA8 的类囊体位置。

CIA8 转录本在极低 （0.01%） 的 CO₂ 浓度下积累表明它参与 CCM [201]。在 CO₂ 限制条件下，CIA8 突变体生长减少，对 C 的亲和力降低，光合氧析出速率降低。然而，CIA8 表达不受 CCM 主调节因子 CIA5 的调节。CIA8 在衣藻细胞中的确切位置以及这种蛋白质所发挥的生理作用仍然未知。

三种最佳啡肽样蛋白，BST1、BST2和BST3（LCI11），代表了莱茵梭菌类囊体膜中其他潜在的碳酸氢盐转运蛋白[202]。这些蛋白质相互作用[102]。BST1-3 存在于基质和类焦烯类囊体内膜中，在类焦烯类囊体的外围有显著的浓度[202]。有人提出，BST1-3 与人类 bestrophin [235] 一样，起阴离子通道的作用。然而，需要确认 BST1-3 转运 HCO₃⁻ 的能力。

BST1-3 参与莱茵梭菌的 CCM，因为 BST1-3 基因的表达受 CIA5 控制，在低 CO 2 和极低 CO₂ 下强烈增加 [202,203,204]。BST1-3 表达降低的突变体无法在低 CO₂ 下生长，对 C 的亲和力降低，对 C 的摄取减少 [202]。BST1 和 BST3 与叶绿体基质中的 C 转化系统以及与 LCIB/LCIC 复合物的相互作用 [102] 也表明它们参与了 CCM。

5.2.4. 线粒体 C 转运蛋白

莱茵梭菌的线粒体膜含有CCP1和CCP2蛋白[28]，它们属于MCP（线粒体载体蛋白）超家族。以前，CCP1 和 CCP2（叶绿体载体蛋白）被称为叶绿体膜蛋白，因为它们最初存在于分离的叶绿体部分[236,237,238]。

CCP1 和 CCP2 的表达受 CIA5 控制，在 CO₂ 极低时，VL 细胞中的表达显著增加 [203,204]。CCP1 和 CCP2 缺陷的敲除表现出生长迟缓，而 C 的积累和对 C 的光合亲和力不受影响 [236]。

研究表明，CCP1 和 CCP2 在适应 C 缺乏过程中参与了 C 从线粒体到叶绿体的转运 [22]。假设线粒体 CA （第 5.3.3 节） 参与呼吸和光呼吸过程中释放的 CO₂ 的转化。所得的 HCO₃⁻ 可以在 RPP 循环中返回叶绿体进行回收。这个过程在 VL 细胞中应该特别重要，使它们能够节省细胞内 C 的资源。

5.3. C. reinhardtii 叶绿体基质中的碳酸酐酶和 C 转化系统

CA 酶可相互转化两种形式的 C、CO₂ 和 HCO₃⁻，是微藻 CCM 的第二个重要元素。在莱茵梭菌基因组中发现了 14 个基因，这些基因编码已证实的和潜在的 CA（表 2）。其中 3 种蛋白属于 α 类 （CAH1、CAH2 和 CAH3），6 种属于 β 类 （CAH4-9），3 种属于 γ 类 （CAG1-3）。另外两种蛋白是LCIB和LCIC，它们可能属于CA的θ类[82,213,239]。上面列出的 CA 在细胞中的位置不同，发挥着不同的生理作用 [82,240]，下文将进一步讨论。

主 CCM 调节因子 CIA5 调节许多莱茵梭菌 CA 基因的转录，在碳限制条件下增强（表 2）。迄今为止，实验中只有以下蛋白被归因于 CCM：CAH1、CAH3 和 LCIB/LCIC 复合物 [9,102,240]。研究表明其他蛋白 （CAH2 、 CAH4 、 CAH5 、 CAH6 、 CAG1 、 CAG2 和 CAG3 ） 可能间接参与 CCM。

5.3.1. 周质间隙的 CA

莱茵梭菌的基因组包括两个基因，CAH1和CAH2（碳酸酐酶1/2），它们编码位于周质间隙的高度同源的α-CAs[241,242,243]。[9,240,244]中回顾的大量研究表明，CAH1 参与在低或极低 CO₂ 下维持 CCM 功能。CAH1 的功能归因于将 HCO₃⁻/CO₂ 递送到质膜中的 HLA3 和 LCI1 转运蛋白。与CAH1相比，莱茵梭菌细胞中的CAH2含量相当低[244]。应该注意的是，CAH2 基因的转录水平非常低，并且这个过程不受 CIA5 或降低的 CO₂ 浓度的调节（表 2）。CAH2被认为在莱茵梭菌的CCM中不起作用，而是需要吸收高浓度的_CO2[204,241]。

除了α类CAH1和CAH2外，在莱茵梭菌细胞中还发现了两种同源的β类CA，即CAH7和CAH8，它们的特异性活性得到了证实[245]。CAH8 位于周质间隙，靠近质膜 [245]。如果 CAH8 真的与膜相关，则仍然未知其活性中心在膜的哪一侧;以前认为它面向周质空间[244]。虽然 CAH7 的确切位置尚未确定，但已经假设了 CAH8 的类似细胞外位置 [245]。关于 CAH7/8 生理功能，尤其是它们在 CCM 中的作用，一直存在争议。

5.3.2. 推定的胞质 CA

莱茵梭菌的CAH9基因编码β类染色体异常，但其活性尚未得到证实[85,244]。应该注意的是，名称“CAH9”最初是指线粒体 γ 类 CA，现在称为 CAG3（GenBank ID AAS48197 和 AY463240）。如今，“CAH9”这个名字指的是 GenBank ID ADW08083的蛋白质。这种蛋白质缺乏前导序列，它位于微藻细胞质中[102]。CAH9 在 C. reinhardtii 细胞中以低和高 CO₂ 浓度的转录非常弱;细胞中相应蛋白质的含量也很低[244]。目前，这种 CA 被认为在 C 积累和 CO₂ 固定中不起重要作用 [203,244]。

 5.3.3. 线粒体 CA

莱茵梭菌的线粒体含有属于β类 CA 的 CAH4 和 CAH5 蛋白 [102,246]。CAH4/5 转录受到 CO₂ 浓度的严格调节 [203,204,247]。这两种蛋白质都只存在于 L 细胞中，而在 H 细胞中不存在 [244]。

CAH4/5 直接参与 CCM 是值得怀疑的 [9]。这些蛋白质与线粒体碳酸氢盐转运蛋白CCP1/2（第5.2.4节）一起，可以防止CO₂（在线粒体呼吸和光呼吸过程中产生）从细胞中泄漏，引导其在RPP周期中进一步固定[248]。参与这种经济的细胞内 C 消耗可能解释了 CAH4/5 在低 CO₂ 条件下的积累。

此外，在莱茵梭菌线粒体中发现了三种潜在的γ类染色体突变体，以及CAG1、CAG2和CAG3（Glp1）[102,249,250]。CAG1-3基因是组成型表达的，对降低的_CO2浓度没有任何反应[204]。仅评估了重组 CAG3 的 CA 活性，但未得到证实 [250]。如果 CAG1-3 确实具有酶活性，那么它们的功能与 CAH4/5 一样，将是防止呼吸和光呼吸过程中产生的 CO₂ 泄漏 [240]。

5.3.4. 叶绿体 CA 和 C 转换系统

CAH3—类囊体腔的碳酸酐酶

α 类 CA，CAH3，位于莱茵梭菌的类囊体腔中 [251]。CAH3 mRNA的量随着_CO2浓度的降低而略有增加[203,204]。CAH3 表达水平在莱茵梭菌 CIA5 破坏的突变体中没有明显变化，表明该 CCM 调节因子不参与 CAH3 调节（[203]，补充数据）。

CAH3 是一种组成型蛋白，在低浓度和高浓度 CO₂ 下都需要 [251]。CAH3在CCM中起关键作用：它向Rubisco提供CO2分子，从类梨类囊体腔中的HCO₃⁻产生_CO2分子[60,91,252,253]。在进行初级光合反应的基质类囊体中，CAH3 与 PSII 反应中心的多肽结合 [65]。CAH3通过加速去除水氧化反应过程中释放的H⁺，有助于稳定PSII的锰簇[92,93,94,254,255,256]。因此，CAH3 有助于促进水中向 PSII 的电子捐赠，并参与光合作用光反应的调节。

组成型复合物 LCIB/LCIC——叶绿体基质中推定的 θ 类 CA 和 C 转换系统

LCI 家族的 5 种蛋白编码于莱茵梭菌基因组中：LCIA、LCIB、LCIC、LCID 和 LCIE [9]。LCIA 是一种叶绿体包膜蛋白，可将 HCO₃⁻ 从胞质溶胶转运到质体基质（第 5.2.2 节）。与 LCIA 相比，LCIB-E 蛋白是可溶性蛋白，缺乏跨膜结构域。其中，LCIB 和 LCIC 是研究最多的。关于 LCID 和 LCIE 的信息很少：它们的亚细胞定位和功能，包括参与光合 C 同化和 CCM，目前尚不清楚。

晶体学数据显示，LCIB和LCIC是同系物，在结构上类似于硅藻P. tricornutum的活性θ类CA[213,239]。因此，LCIB 和 LCIC 被认为是莱茵梭菌中潜在的 θ 类 CA;然而，它们的特定酶活性尚未得到证实。

LCIB 和 LCIC 这两种蛋白质都存在于莱茵梭菌叶绿体的基质中，它们在那里形成异多聚体复合物 [102,211,212]。LCIB 和 LCIC 是低 CO₂ 诱导的 CIA5 调节基因 [203]。值得注意的是，LCIB/LCIC 复合物也在 H 细胞中检测到，但在 CO₂ 限制条件下，其含量在 L 细胞和 VL 细胞中显着增加。该复合物弥漫分布在 L 细胞的基质中，而集中在 VL 细胞的类焦烯附近 [211,212,257]。复合物的迁移可能是在LCIC和类焦烯的淀粉鞘的帮助下发生的[258,259]。

LCIB/LCIC 参与莱茵梭菌 CCM 已有充分的文献证明。如果 LCIB 和 LCIC 确实具有 CA 活性，则 LCIB/LCIC 复合物应将进入叶绿体的 CO₂ 转化为 HCO₃⁻，从而维持 CO₂ 梯度，以促进其在 L 细胞和 VL 细胞中的摄取 [9]。这种功能类似于蓝藻 NDH-1_3/4 系统的功能（第 4.2 节）。在VL电池中，LCIB/LCIC还可以作为CO₂再捕获系统，防止_CO2转化为HCO₃⁻而从吡啶中泄漏[212,257]。建议 CA 反应由 LCIB 进行，而 LCIC 作为整合结构组分 [9]。

 5.3.5. 鞭毛 CA

CAH6是一种活性β类CA，以前被描述为莱茵梭菌中的叶绿体基质酶[260]。最近使用免疫荧光显微镜对 CAH6 的亚细胞位置进行体内分析，将这种蛋白质分配给鞭毛 [102]。这一发现证实了鞭毛蛋白质组的早期数据[261]，以及叶绿衣藻的整个蛋白质组[262]。CAH6 蛋白存在于 L 细胞和 H 细胞中 [260]。CAH6 在低 CO₂ 环境中略微上调，其转录不受 CIA5 的调节 [203]。CAH6 可能参与衣藻对碳酸氢盐的趋化性，同时确定环境中 C 的含量 [102]。

 5.4. 类除虫

微藻中含有 Rubisco 的微隔室是类除虫，它是蓝藻羧基体的功能类似物。类除虫是位于许多真核微藻叶绿体中的蛋白质复合物[103,263,264]。这些微抗体在叶绿体中表现为电子密集的内含物，通常被淀粉鞘包围，在低 CO₂ 下变得更加明显（图 6a）。类除草体的三维结构、其蛋白质组成和功能，以及与莱茵梭菌中该微隔室相关的 CCM 成分的相互排列，都得到了很好的研究 [101,102,103,105,265,266]。

图 6.C. reinhardtii 细胞中的类 Pyrenoid。（a） 显示衣藻叶绿体内类焦烯的 TEM 图像由 Maria A. Sinetova 博士（KA Timiryazev 植物生理学研究所，RAS，莫斯科）友情提供。比例尺为 1 μm。（b） 衣藻细胞的横截面示意图，显示了圆柱形挂状小管从类囊体堆中分枝，以及它们通过淀粉鞘中的开窗进入挂状体基质。

对莱茵梭菌类核糖菌的蛋白质组学分析表明，除Rubisco外，它还包含约200种蛋白质[266]。其中包括类挂体基质蛋白，这是 Rubisco 的包装和高效运行所必需的。这些包括Rubisco激活酶（伴侣蛋白RCA1），它确保羧化反应以尽可能高的速率进行[95]，以及结构蛋白EPYC1（必需的吡喱类成分），它作为连接子促进吡嘧状物中的Rubisco聚集[267]（以前称为LCI5——低CO₂诱导蛋白5）。莱茵梭菌类核糖菌中存在多种与 CO₂ 和淀粉代谢无关的酶，这表明这些微区室可能执行以前未知的功能。值得注意的是，归因于类焦烯组装的推定甲基转移酶 CIA6 [268] 在类焦烯蛋白质组中未报道（[266]，补充数据）。同时，CIA6 在衣藻细胞中的细胞内位置尚不确定 [102]。

基质和类焦体中的类囊体堆由圆柱形焦状小管连接，这些小管在淀粉粒之间穿过并进入焦状体基质[265]（图6b）。C. reinhardtii 的每个 pyrenoid 小管内部包含 2-8 个平行的小管，当两个或多个类囊体合并成一个共同的大小管时形成。因此，小管的内部内容物充满了叶绿体基质;这解决了 Rubisco 与 RPP 循环的其他酶的明显物理隔离问题。类除虫小管的管腔与基质类囊体的管腔相连，允许叶绿体的光和暗反应协调（图 7）。

图 7.具有小管的 Pyrenoid 小管：在 Pyrenoid 小管进入 Pyrenoid 基质时 C. reinhardtii 细胞横截面平面的示意图。

研究表明，HCO₃⁻通过CIA8和BST1-3转运蛋白从基质侧进入类囊体内部[201,202]，并通过大的类散状体小管的管腔进一步扩散到类囊体内部[265]。或者，碳酸氢盐可以通过微型小管直接扩散到类焦烯管的内部，或者通过其转运蛋白进入类焦烯小管的管腔。小管还携带Rubisco激活酶活性所需的ATP分子的单向扩散以及RuBP和3-PGA的交换，RuBP和3-PGA是Rubisco羧化酶活性的底物和产物[95,264,269]。

向 Rubisco 提供 CO₂ 的 CAH3 位于大 pyrenoid 小管的管腔中 [60,92,250,251]（图 7）。CAH3 对于低 CO₂ 水平下的细胞生长至关重要。在这些条件下，CAH3 被磷酸化并从基质类囊体转移到类梨小管 [67]。同时，磷酸化导致 CAH3 的 CA 活性显著增加。在类囊体小管的管腔中，HCO₃⁻ 被 CAH3 转化为 CO₂（图 7）。照射细胞腔中高浓度的 H⁺ 促进了该反应，从而将 CO₂/HCO₃⁻ 转化反应转向 CO₂ 生成。所得的亲脂性 CO₂ 分子可以从类囊体扩散到类散体基质中，在那里它们在 RPP 循环中被 Rubisco 固定。应该强调的是，与长期以来的信念相反，类辉体基质更像液体，而不是晶体状或无定形的固体结构[101,270]。这些知识可能有助于想象 CO₂ 底物如何渗透到 Rubisco 的活性中心，尽管它的表观密度很高。

类除虫被认为在空间上将 Rubisco 与析氧复合物分开，因为类除虫的类囊体膜富含活性 PSI 复合物，而不含 PSII [95,266]。这种安排导致低 O₂/CO₂ 比率，有利于羧化酶对 Rubisco 的功能并降低其加氧酶活性。尽管在莱茵芽孢杆菌中检测到荧光标记的PSI和PSII、细胞色素b₆/-复合物和ATP合酶[102]，但这些结果与分离的类辉体获得的蛋白质组学数据相矛盾[266]。

类除虫胺通常被淀粉鞘包围，在适应低_CO2的过程中，淀粉鞘的厚度会增加[58]。类焦烯基质和淀粉鞘通过蛋白 SAGA1（淀粉颗粒异常 1）结合在一起，SAGA1 也调节淀粉鞘形态 [104]。据信，淀粉鞘可以作为屏障，防止 CO₂ 从类焦烯中泄漏。然而，令人惊讶的是，没有鞘并不影响CCM活性[66,74,271]。迄今为止，淀粉鞘的阻隔作用尚未得到证实或反驳。然而，它的形状（形态）已被证明与 CCM 的功能 [104] 和 LCIB 蛋白的正确定位密切相关 [259]。此外，类挂虫定位蛋白 SAGA1 对于编码 C 转运蛋白的 HLA3 和 LCIA 基因的 CAS 依赖性表达是必需的 [106]。

5.5. C语言在不同可用性下的莱茵梭菌CCM模型_i

目前公认的微藻细胞中 CCM 方案通常与初始模型没有实质性区别 [87,91,252,272,273,274]。然而，由于 40 多年的研究获得了有关其分子成分、亚细胞位置和功能的信息，它现在得到了更好的解决。图 8 显示了莱茵梭菌在不同 CO₂ 供应下的光合 C 同化方案。

Figure 8. Schematic of photosynthetic C_i assimilation in C. reinhardtii under different CO₂ supply. (a) H-cells growing under conditions of elevated CO₂ concentrations (2–5%), with inactive CCM; Generalized model of CCM functioning in C. reinhardtii cells grown at: (b) low (0.03–0.5%; L cells) and (c) very low (<0.02%; VL cells) CO₂ concentrations. The scheme shows bicarbonate entry into the lumen of intrapyrenoid thylakoids (pyrenoid tubules) from minitubules in L- and VL-cells, and does not take into account the participation of transporters located on membranes on the stroma side. Abbreviations: ChE—chloroplast envelope; PM—plasma membrane; SS—starch sheath; TM—thylakoid membrane; CAH3*, activated enzyme. The preferential pathways of C_i fluxes in the corresponding acclimation state of the cell are shown in bold.

Figure 8a shows the photosynthetic CO₂ fixation pathway in H-cells grown at elevated CO₂ concentrations (2–5%) in the absence of the active C_i uptake. Under these conditions, the photosynthesis is ensured by the following CCM components: CAs CAH2 and CAH3, CO₂-channels RHP1/2, and the LCIB/LCIC complex. CO₂ can enter the cell by a direct diffusion through cell membranes. The CO₂ transport channels (RHP1/2) located in the plasma membrane may exert their functions with the participation of CAH2 [241]. At elevated CO₂ concentrations, the pyrenoid structures are weak, the starch sheath is absent and Rubisco is located mainly in the stroma. Thus, the CO₂ entering the cell is fixed in the RPP cycle directly in the chloroplast stroma. At the same time, the LCIB/LCIC complex can convert the CO₂ entering the cell into HCO₃⁻; this process is facilitated by slightly alkaline stromal pH values. Under the C_i excess, the main physiological role of the lumenal CA of thylakoids, CAH3, is obviously not in generation of CO₂ for Rubisco, but in the protection of WOC of PSII from the excess of protons generated due to the activity of the electron transport chain [94]. HCO₃⁻ molecules enter into the lumen of stromal thylakoids via BST1–3 and CIA8 transporters. CAH3 catalyzes the interaction of HCO₃⁻ with protons to form CO₂, which diffuses according to a concentration gradient into the stroma, where it can be consumed for RuBP carboxylation. The constitutive expression of LCIB and CAH3 proteins under high CO₂ allows cells to respond immediately to the CO₂ shortage, avoiding the delay associated with the de novo synthesis of the complete set of CCM proteins [9].

Figure 8b,c shows the organization of the CCM in the L- and VL-cells of C. reinhardtii adapted to low (0.03–0.5%) and very low (<0.02%) CO₂, respectively. It is assumed that the high CO₂ concentration near the Rubisco active centers under these conditions is achieved, as follows.

(1)

CAH6, located in the flagella of C. reinhardtii [102], may estimate an ambient C_i concentration, providing the orientation of cells relative to its gradient and enabling the directional chemotaxis (not shown in Figure 8).

(2)

C_i enters into the cell and further into the chloroplast by active transport in two forms, HCO₃⁻ and CO₂. The periplasmic CA, CAH1, evidently contributes to the interconversion of C_i forms and participates in the supply of substrates for the plasma membrane transporters. The transport of HCO₃⁻ through the plasma membrane and chloroplast envelope is facilitated by the cooperative operation of HLA3 and LCIA [28,102,222]. It appears that the active HCO₃⁻ uptake occurs only in VL-cells, whereas in L-cells, the HLA3 and LCIA transporters are inhibited by CO₂ [223]. The CO₂ uptake in both L- and VL-cells may be due to its facilitated diffusion, driven by light-dependent stromal alkalinization and the operation of the LCIB/LCIC complex [9,257]. In L-cells, the flow of CO₂ inside the cell is additionally provided by the LCI1 channel [228]. CO₂ can enter the chloroplast not only by direct diffusion, but also through some, as of yet, unidentified transporter. The absorbed C_i accumulates in the chloroplast stroma in the form of HCO₃⁻, which is facilitated by its slightly alkaline pH values.

(3)

Stromal HCO₃⁻ enters inside the thylakoids with the participation of CIA8 and BST1–3 transporters located in membranes on the stroma side, followed by a diffusion deep into the pyrenoid along the lumen of large pyrenoid tubules [201,202]. Simultaneously, HCO₃⁻ can diffuse inside the pyrenoid along the stroma inside the minitubules and then enter the lumen of intrapyrenoid thylakoids via transporters. The conversion of HCO₃⁻ into CO₂ in the lumen of intrapyrenoid thylakoids is performed by CAH3, which exploits the inherently acidic pH value of this compartment [9,60,85,92].

(4)

CO₂ formed in the intrapyrenoid thylakoid lumen diffuses into the pyrenoid matrix, where it is fixed by Rubisco in the RuBP carboxylation reaction. The co-localization of Rubisco and CA in the pyrenoid is the cornerstone of the CCM scheme, necessary for the efficient incorporation of CO₂ into the initial chain of organic carbon transformations in the cell.

(5)

The prevention of CO₂ leakage from the chloroplast is also very important. The current CCM model suggests that this process is primarily important in VL-cells [9,10]. This function is performed by the LCIB/LCIC protein complex (C_i conversion system) located in the chloroplast stroma. In VL-cells, the complex migrates to the periphery of the pyrenoid and acts as a vector module for the conversion of CO₂ that escaped from the pyrenoid into HCO₃⁻ [211] (Figure 8c). This assumption is based on the high probability that LCIB/LCIC possess the CA activity. Under low CO₂, the main function of the LCIB/LCIC complex is probably to hydrate the incoming cellular CO₂ with the formation of HCO₃⁻ in the stroma [212].

(6)

It is assumed that mitochondrial CAs and C_i transporters may participate, although indirectly, in the CCM of C. reinhardtii [22,244,248] (not shown in Figure 8). The CO₂ generated during photorespiration and respiration in these organelles can be converted by CAH4 and CAH5 into HCO₃⁻, with the latter released into the cytosol via CCP1/2 transporters. Then, HCO₃⁻ can be returned to the chloroplast and reintroduced into the dark phase of photosynthesis.

6. Conclusions

The CCM of microalgae and cyanobacteria has been actively studied over the past 40 years after its discovery in the 1980s. The most significant progress in the study of its cellular and molecular organization (especially in microalgae), and understanding the subtleties of this mechanism functioning and regulation, have been made in the last decade due to the development of omics methodology and structural analysis. Many aspects of the CCM organization and regulation are being revised and evolved on a constant basis. Yet, some critical parts and characteristics of CCM operation remain unexplored. The following are the primary “hot spots” that warrant more investigation:

• More nuanced understanding of the mechanisms of CCM regulation. In particular, it remains largely unclear how its light regulation is performed;
• In-depth study of the functioning of the CA system and C_i transport;
• Determination of the mechanisms by which CO₂ enters the algal chloroplast;
• Confirmation of the CA activity of the LCIB/LCIC complex in algae and CupA/B proteins in cyanobacteria;
• Evaluation of external, mitochondrial, and flagella CAs for their participation in photosynthetic assimilation of C_i and CCM;
• More direct experimental measurements of pH values in the periplasmic space of microalgae and cyanobacterial cells, as well as the pH of the carboxysomal matrix in cyanobacteria, would aid in understanding the role of CAs in C_i flow control;
• Clarification of the involvement of CIA6 protein in pyrenoid biogenesis, and the exact role of the starch sheath in the CCM;
• Currently, the CCM has been studied in detail only in model laboratory species of cyanobacteria and microalgae. However, the sets of CCM components and the significance of this mechanism may differ in species inhabiting different ecological niches;
• In addition, special attention should be paid to the study of the evolutionary origin of CCM in interrelation with the geological history of Earth and the history of the biosphere.