Highlights 亮点
- •We use chemoproteomic platforms to discover a covalent molecular glue degrader
我们使用化学蛋白质组学平台发现一种共价分子胶粘剂降解剂 - •We identify a cysteine-reactive covalent glue degrader EN450
我们确定了一种半胱氨酸反应性的共价粘合剂降解剂 EN450 - •EN450 glues together E2 ubiquitin-conjugating enzyme UBE2D with NFKB1
EN450 使用 E2 泛素连接酶 UBE2D 与 NFKB1 粘合在一起
Summary 摘要
针对蛋白质降解已经成为一种强大的治疗模式,用于降解疾病靶标。虽然蛋白质降解靶向嵌合物(PROTAC)设计更具模块化性,但发现分子粘合剂降解物却更具挑战性。在这里,我们将共价配体库的表型筛选与化学蛋白质组学方法相结合,快速发现了一种共价分子粘合剂降解物及其相关机制。我们确定了一种半胱氨酸反应性共价配体 EN450,以 NEDDylation 和蛋白酶体依赖的方式损害了白血病细胞的生存能力。化学蛋白质组学分析显示 EN450 与 E2 泛素连接酶 UBE2D 中的一个变构 C111 发生共价相互作用。定量蛋白质组学分析显示了致癌转录因子 NFKB1 的降解作为一个潜在的降解靶标。因此,我们的研究提出了一种共价分子粘合剂降解物的发现,其独特地诱导了 E2 与转录因子的接近,从而在癌细胞中诱导其降解。
Graphical abstract 图形摘要
Keywords 关键词
Introduction 介绍
临床上大多数小分子药物通过经典的占位驱动药理学发挥作用,即小分子结合到深层活性位点结合口袋,导致靶点的功能调节。然而,许多治疗靶蛋白被认为是“难药化”的,因为它们没有明确定义的、功能相关的结合口袋,因此这些蛋白对经典药物发现方法是不可及的。利用异双功能蛋白降解靶向融合物(PROTACs)或分子胶已成为一种强大的替代治疗模式,旨在降解疾病靶点而不是抑制它。虽然异双功能 PROTACs 仍需要能够具有相当强效的结合到靶蛋白的蛋白靶向配体,但单价分子胶降解剂可以利用较浅的蛋白界面诱导三元复合物形成,随后泛素化和降解特定蛋白。 虽然分子胶黏剂降解剂可能更具吸引力和药物样性,但大多数分子胶黏剂降解剂都是偶然发现的,而对分子胶黏剂降解剂的理性发现仍然具有挑战性。
Mayor-Ruiz等人最近的研究展示了创新的表型筛选范式,用于快速发现通过分子胶附降解机制发挥抗癌活性的小分子。这些用于抗癌小分子的筛选包括对缺乏泛素化细胞系中的衰减表型进行对照筛选,以识别通过Cullin E3连接酶依赖机制发挥其表型的分子。然而,三元复合物组分的后端机制阐明——识别由小分子汇集在一起的降解目标和泛素蛋白酶体组分——需要全基因组CRISPR筛选,这有时可能是费力的,并且可能会产生除小分子直接靶标外的间接靶标。
共价化学蛋白质组学方法已经成为将共价亲电子库的表型筛选与快速机械解构相结合的强大平台。因此,我们推测,将共价配体库的筛选与后端化学蛋白质组学和定量蛋白质组学方法相结合,将快速发现分子胶粘剂降解剂及其三元复合物组分和下游机制。在这项研究中,我们对一系列共价配体进行了表型筛选,寻找抗增殖化合物,并利用化学蛋白质组学平台发现了一种共价分子胶粘剂降解剂,其独特依赖于E2泛素连接酶。
Results 结果
为了发现共价分子粘合剂降解剂,我们在HAP1白血病癌细胞中筛选了一个包含750个半胱氨酸反应性共价配体的文库,以寻找抗增殖效应(图1A和表S1)。我们从初筛中鉴定出11个命中物,其中三个命中物——EN222、EN450和EN266——显示出HAP1细胞增殖受到超过90%的可重复损害(图1B)。在这三个命中物中,我们接下来试图确定这些化合物是否通过Cullin E3泛素连接酶依赖机制发挥其抗增殖效应。为此,我们在UBE2M敲除的hyponeddylation细胞系中与dCeMM1进行了对照筛选,dCeMM1是由Mayor-Ruiz等人先前鉴定的一种阳性对照分子粘合剂降解剂,以CRL4 DCAF15 -依赖方式诱导RBM39的降解(图1C和1D)。

图1 在HAP1白血病癌细胞中发现具有抗增殖活性的共价分子粘合剂降解剂
- Zhang X.
- Crowley V.M.
- Wucherpfennig T.G.
- Dix M.M.
- Cravatt B.F.
根据这些数据,我们推测 EN450 是一种分子胶,诱导靶蛋白与泛素蛋白酶体系统(UPS)的组分接近,形成三元复合物,导致靶蛋白泛素化和蛋白酶体介导的降解,进而在 HAP1 细胞中产生抗增殖效应。为了识别 EN450 的蛋白组全范围共价靶标,我们使用同位素串联正交蛋白酶活性基因组学(isoTOP-ABPP)进行半胱氨酸化学蛋白组学分析。通过在 HAP1 细胞中进行 EN450 共价蛋白靶向的竞争性分析,对半胱氨酸反应性炔基功能碘乙酰胺探针标记,我们确定了 81 个靶标,这些靶标显示出显著的参与度—控制/EN450 处理比>1.3,调整后的 p 值<0.05—在 4,501 个半胱氨酸中定量(图 2A 和表 S2)。 考虑到我们和其他人先前已经表明UPS与共价配体具有很高的结合性,即使UPS效应蛋白的部分共价占据也会由于降解剂的催化性质导致目标蛋白的显著降解,并且EN450是一种不太可能参与高亲和力相互作用的小分子片段,我们推测EN450的共价相互作用可能发生在泛素蛋白酶体系统的一个组分上,而不是目标蛋白。由于这些原因,我们有意选择了一个较低的比例截断值,因为我们不想错过EN450的低占有率目标。在这些目标中,只有一个蛋白参与了UPS和Cullin E3连接酶机制——泛素连接酶E2D(UBE2D)的C111。C111是UBE2D中的一个远离在泛素转移过程中发生泛素连接的半胱氨酸(C85)的变构半胱氨酸。 由于UBE2D同工型之间的序列同源性较高,我们无法区分EN450是否靶向UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3或UBE2D4上的C111。尽管如此,UBE2D是与Cullin E3连接的关键E2连接酶之一,这与使用Cullin E3连接的NEDDylation抑制剂减弱EN450抗增殖效应的结果一致。

图2 HAP1细胞中EN450靶点的化学蛋白质组学分析和验证
为了进一步表征EN450与UBE2D的相互作用,我们合成了EN450的炔基功能化探针衍生物EK-1-8(图2B)。EK-1-8仍然以NEDDylation依赖的方式影响HAP1细胞的存活能力(图2C)。EK-1-8以剂量响应的方式直接和共价地标记了重组的UBE2D1 C85S突变蛋白(图2D)。尽管在UBE2D1的C85和C111都突变为丝氨酸时,这种标记有所减弱,但并非完全消失(图S1A)。我们将双突变体中残留的标记解释为UBE2D1上另一个可能与EN450发生反应的变构半胱氨酸,可能在其主要反应位点C111缺失的情况下发生反应。我们进一步证明了EK-1-8与UBE2D1发生了相互作用,但与HAP1细胞中的GAPDH等无关蛋白不发生相互作用,并且通过叠氮-炔基环加成(CuAAC)连接生物素,通过亲和素富集、洗脱和印迹分析(图2E)部分地被EN450所取代。 我们还合成了EN450的非反应性类似物EK-1-37,以及其炔基功能化衍生物EK-1-38,以确定共价丙烯酰胺战斧对观察到的效应的贡献(图S1B)。EK-1-37不影响HAP1细胞的存活能力,EK-1-38预期地与EK-1-8相比没有显示对UBE2D1 C85S的任何共价修饰(图S1C和S1D)。
为了理解个体UBE2D同工酶对EN450效应的贡献,我们评估了在敲除UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3和UBE2D4以及敲除所有四种酶的情况下,EN450对HAP1细胞增殖的剂量响应效应(图2F、2G和S2)。敲除UBE2D1对EN450的抗增殖效应产生了最大程度的抵抗,其次是敲除UBE2D4和敲除所有四种酶。有趣的是,敲除UBE2D2和UBE2D3导致对EN450的过敏反应,表明每个单独的E2连接酶同工酶在与EN450的相互作用中可能具有不同的作用,尽管它们具有高度相似的序列(图2F、2G和S1)。尽管如此,我们的数据表明,UBE2D1和UBE2D4很可能是EN450共价结合的UPS组分,可能与其相关的Cullin E3连接酶复合物一起,泛素化和降解一个尚未知的靶蛋白,以发挥其抗增殖效应。
- Chen Y.
- Sun L.
为了识别降解的靶蛋白,我们接下来进行串联质谱标记(TMT)基础的定量蛋白质组学分析,以绘制HAP1细胞中EN450处理引起的蛋白水平变化。这项分析揭示了只有一个蛋白质——NFKB1 p105亚基,在EN450处理后与车辆处理对照相比水平显著降低了超过4倍(图3A和表S3)。通过免疫印迹验证了NFKB1的前体p105蛋白和进一步加工的p50产物的丧失(图3B-3D)。非反应性的EK-1-37对照未降低NFKB1水平(图S3A)。我们进一步确认,当HAP1细胞预先用NEDDylation抑制剂处理时,EN450处理不会导致NFKB1 p105和p50水平的降低(图3E和3F)。MLN4924处理本身降低了NFKB1水平,可能是由于其在白血病癌细胞中的固有毒性,但EN450并未进一步降低NFKB1水平(图3E和3F)。

图3:鉴定被EN450降解的蛋白质
接下来,我们试图证明EN450介导的UBE2D和NFKB1之间的三元复合物形成。首先,我们通过重组GST-NFKB1和UBE2D1蛋白的拉下研究表明EN450促进了UBE2D1和NFKB1之间的三元复合物形成(图3G和3H)。然后,我们展示了除了我们先前描述的UBE2D1的拉下结果外,EK-1-8还从HAP1细胞中拉下了p105和p50 NFKB1亚型,而与无关的GAPDH对照无关(图2E和S3B)。第三,UBE2D1介导的泛素化活性的重构显示,EN450仅在完整的CUL4A/RBX1/NEDD8复合物存在时增强了NFKB1的泛素化(图3I和3J)。我们还证明,仅仅UBE2D1的沉默对NFKB1水平没有影响(图S3C)。总的来说,这些结果与EN450在细胞中形成了一个有益的UBE2D和NFKB1之间的三元复合物,导致了NFKB1的泛素化和降解是一致的。
EN450显然不是一种选择性化合物,这是通过化学蛋白质组学分析鉴定出的约80个潜在半胱氨酸靶点所证明的。尽管如此,我们试图将已知的致癌转录因子NFKB1的降解与EN450抗增殖效应的机制联系起来。在HAP1细胞中稳定过表达NFKB1显著减弱了EN450介导的抗增殖效应,且呈剂量依赖性(图4A和4B)。我们还在HEK293T细胞中瞬时转染NFKB1,结果显示NEDDylation依赖的细胞存活受损以及EN450处理后NFKB1水平降低(图4D和4E)。我们观察到EN450介导的抗增殖效应得到了更强有力的恢复(图4F)。虽然我们认为EN450可能具有其他多药机制来支持其抗增殖效应,但我们的数据表明NFKB1至少部分参与了EN450的抗癌效应。

图4:理解NFKB1在EN450介导效应中的作用
Discussion 讨论
- Forte N.
- Dovala D.
- Hesse M.J.
- McKenna J.M.
- Tallarico J.A.
- Schirle M.
- Nomura D.K.
- Lazear M.R.
- Remsberg J.R.
- Jaeger M.G.
- Rothamel K.
- Her H.
- DeMeester K.E.
- Njomen E.
- Hogg S.J.
- Rahman J.
- Whitby L.R.
- et al.
- Lazear M.R.
- Remsberg J.R.
- Jaeger M.G.
- Rothamel K.
- Her H.
- DeMeester K.E.
- Njomen E.
- Hogg S.J.
- Rahman J.
- Whitby L.R.
- et al.
在这项研究中,我们使用共价化学蛋白质组学方法发现了一种共价分子胶黏剂降解剂,其独特地诱导E2结合酶UBE2D1与致癌的核转录因子NFKB1的接近,以泛素化和降解NFKB1,这是依赖于蛋白酶体和NEDDylation的方式。我们的研究还揭示了E2泛素结合酶内的变构位点,而不是E3连接酶或E3连接酶底物受体或适配蛋白,可以直接被小分子靶向,与新底物蛋白发生分子胶黏相互作用。我们的研究让人想起了Słabicki等人先前报道的研究,证明CDK8抑制剂CR8通过与CUL4 E3连接酶机制的核心适配蛋白DDB1发生分子胶黏相互作用,从而绕过了泛素化和降解所需的底物受体的要求,作为环K的分子胶黏降解剂。我们的研究和Słabicki等人的研究都表明,泛素-蛋白酶体机制内的核心蛋白,如E2连接酶和DDB1,可以被利用于靶向蛋白质降解应用。 这表明可以针对UPS的核心组分开发小分子招募剂,用于异双功能降解剂。在本文修订期间,我们还证明了EN450和更强效的UBE2D共价招募剂均可用于PROTACs以降解新底物蛋白。更广泛地说,我们的研究还展示了将共价配体筛选与化学蛋白组学和定量蛋白组学平台相结合,快速发现分子胶降解剂及其三元复合组分的实用性。此外,通过开发定制化合物库,包括共价对映体库或共价大环化合物库,以及将这些专门库与化学蛋白组学平台以及基于靶标的细胞筛选或尺寸排除色谱相结合,我们可能会发现更多的分子胶降解剂。
- Lazear M.R.
- Remsberg J.R.
- Jaeger M.G.
- Rothamel K.
- Her H.
- DeMeester K.E.
- Njomen E.
- Hogg S.J.
- Rahman J.
- Whitby L.R.
- et al.
Limitations of the study 研究的局限性
我们的研究揭示了一种共价分子粘合剂降解剂,它与E2泛素连接酶UBE2D相互作用,与NFKB1发生分子粘合作用,导致癌细胞中NFKB1的降解。尽管我们的研究仍然存在一些限制和未解之谜。虽然NEDDylation依赖性表明UBE2D仍然需要与Cullin E3连接酶复合物结合,将NFKB1标记为降解物,并通过NEDDylation抑制剂减弱这些效应来提供抗增殖效应,但我们尚不清楚E2的招募是否绕过了需要底物适配蛋白来诱导NFKB1的泛素化和降解。我们也承认,在这里重建三元复合物所使用的NEDDylated CUL4/RBX1并不是理想的RING E3连接酶,无法解决C111对UBE2D1在激活结构上的作用,因为NEDD8结合UBE2D。因此,我们观察到的泛素化活性可能不仅仅依赖于RING引起的折回的UBE2D1-泛素排列,正如先前文献中所描述的那样。 由于在获取足够纯净蛋白进行所有必要的对照实验以进行重组实验的限制,我们无法在这些实验中测试阴性对照化合物,因此无法排除小分子产生超出我们假设的影响。 NFKB1降解的机制也可能通过NFKB1的初级单泛素化,通过EN450介导的UBE2D/NFKB1分子粘合相互作用,随后使NFKB1对多泛素化和降解产生敏感性,通过一种或特定的E3连接酶的组合。未来感兴趣的是调查NFKB1是否已经与UBE2D的这个变构位点弱交互,并且EN450是否仅加强已经存在的相互作用,或者NFKB1是否真正代表一个新底物,只有在EN450结合时才与UBE2D发生相互作用。虽然我们在这里证明EN450直接与UBE2D1结合而不需要NFKB1,但目前尚不清楚EN450是否具有与NFKB1的任何固有可逆亲和力,或者UBE2D1结合EN450是否需要招募NFKB1。 我们承认EN450是一个初步筛选命中物,不够选择性或有效,并且可能在癌细胞中具有多药作用。未来改进的基于UBE2D的NFKB1降解剂有可能用于识别特别敏感的癌细胞,这些细胞可能对NFKB1降解产生治疗反应,超出白血病范围。
STAR★Methods STAR★方法
Key resources table 关键资源表
REAGENT or RESOURCE 试剂或资源 | SOURCE | IDENTIFIER |
---|---|---|
Antibodies | ||
Rabbit monoclonal anti-NFKB p105/p52 兔单克隆抗-NFKB p105/p52 | Abcam | Cat#ab323670; RRID:AB_776748 猫#ab323670; RRID:AB_776748 |
Rabbit monoclonal anti-SFT 兔单克隆抗-SFT | Abcam | Cat#ab176561 |
Mouse monoclonal anti-UBE2D2 鼠单克隆抗-UBE2D2 | Origene | Cat#TA806600; RRID:AB_2628172 猫#TA806600;RRID:AB_2628172 |
Rabbit monoclonal anti-UBE2D3 兔单克隆抗-UBE2D3 | Abcam | Cat#ab176568 |
Mouse monoclonal anti-UBE2D4 鼠单克隆抗-UBE2D4 | Invitrogen | Cat#MA5-27358; RRID:AB_2725609 猫#MA5-27358; RRID:AB_2725609 |
Rabbit monoclonal anti-UBE2M/UBC12 兔单克隆抗-UBE2M/UBC12 | Abcam | Cat#ab109507; RRID:AB_10892148 猫#ab109507; RRID:AB_10892148 |
Rabbit monoclonal anti-DYKDDDDK tag 兔单克隆抗-DYKDDDDK 标签 | Cell Signaling Technology 细胞信号技术 | Cat#14793; RRID:AB_2572291 猫号14793; RRID:AB_2572291 |
Mouse monoclonal anti-vinculin 鼠单克隆抗-维库林 | Bio-Rad | Cat#MCA465S; RRID:AB_2214389 猫#MCA465S; RRID:AB_2214389 |
Mouse monoclonal anti-GAPDH 鼠单克隆抗 GAPDH | Proteintech | Cat#60004-1-Ig; RRID:AB_2107436 猫#60004-1-Ig; RRID:AB_2107436 |
Goat anti-mouse IgG IRDye 680RD Secondary Antibody 山羊抗小鼠 IgG IRDye 680RD 二抗 | LI-COR | Cat#926–68070; RRID:AB_10956588 |
Goat anti-rabbit IgG IRDye 800CW Secondary Antibody 山羊抗兔 IgG IRDye 800CW 二抗 | LI-COR | Cat#926–32211; RRID:AB_621843 猫#926-32211; RRID:AB_621843 |
Bacterial and virus strains | ||
One-Shot™ Stbl3™ Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C737303 |
HI-Control BL21 (DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60435–1 |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | ||
Recombinant Human UbcH5a/UBE2D1 Protein, CF | Boston Biochem Inc. | Cat#E2-616-100 |
Recombinant Human Ubiquitin-Activating Enzyme (UBE1), CF | Boston Biochem Inc. | Cat#E−305 |
Recombinant Human CUL4A/NEDD8/RBX1A Complex Protein, CF | Boston Biochem Inc. | Cat#E3-441 |
Recombinant Human FLAG-Ubiquitin Protein, CF | Boston Biochem Inc. | Cat#U-120 |
Recombinant Human UBE2D1 (1–147) | This paper | N/A |
Recombinant Human UBE2D1 C85S | This paper | N/A |
Recombinant Human UBE2D1 C85S/C111S | This paper | N/A |
Recombinant Human NFkB p105/p50 GST (N-term) Protein | Novus | Cat#H00004790-P01 |
Pierce protease inhibitor mini tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | Cat#A32955 |
Covalent Ligand Library, see Table S1 | Enamine | N/A |
Hoechst 33342 dye | Invitrogen | H3570 |
Bortezomib | Calbiochem | Cat#5043140001; CAS: 179324-69-7 |
NAE Inhibitor, MLN4924 | Calbiochem | Cat#5054770001; CAS: 951950-33-7 |
TAMRA-PEG4-Azide | Click Chemistry Tools, Inc. | Cat#AZ109-5 |
Biotin picolyl azide | Sigma-Aldrich | Cat#900912 |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine, hydrochloride | Strem | Cat#15–7400; CAS:51805-45-9 |
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma-Aldrich | Cat#678937; CAS:510758-28-8 |
Copper(II)sulfate | Sigma-Aldrich | Cat#451657; CAS:7758-98-7 |
High-capacity streptavidin agarose resin | ThermoFisher Scientific | Cat#20357 |
Laemmli SDS sample buffer, reducing (4x) | Alfa Aesar | Cat#J60015 |
Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | Cat#26634 |
Re-Blot Plus Strong Antibody Stripping Solution, 10x | Millipore | Cat#2504 |
N-Hex-5-ynyl-2-iodo-acetamide (IA-alkyne) | Chess Gmbh | Cat#3187; CAS:930800-38-7 |
Biotin-TEV-Azide | Weerapana et al. 13 | N/A |
Streptavidin agarose resin | ThermoFisher Scientific | Cat#20349 |
Iodoacetamide 98% | ACROS Organics | Cat#AC122270050; CAS:144-48-9 |
Sequencing grade modified trypsin, porcine | Promega | Cat#V511A |
UltraPure Dithiothreitol | Invitrogen | Cat#15508013 |
AcTEV Protease | Invitrogen | Cat#12575-015 |
Formic acid, 99.0+%, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | Cat#A117-50; CAS:64-18-6 |
TMTsixplex isobaric label reagent set | ThermoFisher Scientific | Cat#90061 |
Pierce high pH reversed-phase peptide fractionation kit | ThermoFisher Scientific | Cat#84868 |
Opti-MEM Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | Cat#31985062 |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | Cat#11668027 |
DharmaFECT 1 | Dharmacon | Cat#T-2001-02 |
Glutathione Sepharose 4B beads | Cytiva | Cat#17075605 |
N-[2-chloro-5-(dimethylsulfamoyl)phenyl]prop-2-enamide | Enamine | Cat#EN300-7515212 |
Critical commercial assays | ||
Q5 Site Directed Mutagenesis Kit | New England BioLabs | Cat#E0554S |
Deposited data | ||
isoTOP-ABPP and TMT quantitative proteomics data | PRIDE database | PXD039924 |
Experimental models: Cell lines | ||
Human: Hap1 parental cell line | Horizon | Cat#C859 |
Human: Hek293T | ATCC | CRL-3216 |
Oligonucleotides | ||
siRNA: ON-TARGETplus Human UBE2D1 SMARTPool | Dharmacon | Cat#L-0093870-00 |
siRNA: ON-TARGETplus Human UBE2D2 SMARTPool | Dharmacon | Cat#L-010383-00 |
siRNA: ON-TARGETplus Human UBE2D3 SMARTPool | Dharmacon | Cat#L-008478-00 |
siRNA: ON-TARGETplus Human UBE2D4 SMARTPool | Dharmacon | Cat#L-009435-00 |
siRNA: ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | Cat#D-001810-10 |
siRNA: ON-TARGETplus Human UBE2M SMARTPool | Dharmacon | Cat#L-004348-00 |
Recombinant DNA | ||
pMD2.G | Trono Lab Constitutive Lentiviral Plasmids (unpublished) | Addgene plasmid #12259; RRID: Addgene_12259 |
psPAX2 | Trono Lab Constitutive Lentiviral Plasmids (unpublished) | Addgene plasmid #12260; RRID: Addgene_12260 |
pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro NFKB1 | Origene | Cat#RC208384L3 |
pLenti-C-mGFP-P2A-Puro | Origene | Cat#PS100093 |
pCMV6-Entry eGFP | Ward et al. 29 | N/A |
pCMV6-Entry NFKB1 | Origene | Cat#RC208384 |
Software and algorithms | ||
ImageJ | Schneider et al. 30 | https://imagej.nih.gov/ij/ |
IP2 proteomics pipeline 5.0.1 | Integrated Proteomics Applications | N/A |
Resource availability 资源可用性
Lead contact 主要联系
进一步的信息和资源以及试剂的请求应直接发送至并将由主要联系人 Daniel K. Nomura(dnomura@berkeley.edu)履行。
Materials availability 材料可用性
本研究生成的化合物和方案将根据要求提供。本提案生成的任何原始数据或图像将根据要求提供。
Experimental model and subject details
实验模型和受试者细节
Cell culture 细胞培养
HAP1 细胞是从 Horizon Discovery 购买的,并在含有 10%(体积/体积)胎牛血清(FBS)的 IMDM 中培养,并在 37°C 下以 5% CO 2 维持。HAP1 细胞源自男性。HEK293T 细胞来自美国类型培养继续。HEK293 细胞最初来源于女性胎儿,但性别不明。HEK293T 细胞在含有 10%(体积/体积)胎牛血清(FBS)的 DMEM 中培养,并在 37°C 下以 5% CO 2 维持。除非另有说明,所有细胞培养材料均从 Gibco 购买。不清楚 HEK293T 细胞是男性还是女性来源。
Method details 方法细节
Materials 材料
半胱氨酸反应性共价配体库要么是先前合成和描述的,要么是从 Enamine 购买的,包括 EN450 开头的化合物。本研究中合成的其他化学品在支持信息中有描述。
Preparation of cell lysates
细胞裂解的准备
细胞用冷PBS洗涤两次,刮取,经离心(1,400 g,4 分钟,4°C)沉淀。沉淀物在含有蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher A32955)的PBS中重悬,经声波处理,离心澄清(21,000 g,10 分钟,4°C),裂解物转移到另一个低粘附微离心管中。用BCA测定蛋白组浓度,裂解物稀释至适当的工作浓度。
Cell viability
细胞存活率测定采用Hoechst 33342染料(Invitrogen H3570)按照制造商的方案进行。对于存活率测定,细胞被分装到96孔板中(每孔20,000个细胞)中,体积为100μL,并允许其在夜间附着,细胞接受额外50μL含有DMSO载体或化合物(150μM)的培养基,含0.1% DMSO,处理时间为24小时。对于救助实验,细胞培养基在化合物处理前1小时更换为含有Bortezomib(1μM)(Calbiochem 5043140001)或MLN4924(1μM)(Calbiochem 5054770001)的培养基。对于剂量响应实验,化合物的稀释在DMSO中进行,然后在培养基中稀释。孵育后,每孔的培养基被抽取,加入含有10%甲醛和Hoechst 33,342染料(Invitrogen H3570)的100μL染色溶液,暗处室温下孵育25分钟。然后去除染色溶液,用PBS洗涤孔板3次,然后进行荧光成像。
Production of recombinant UBE2D1
重组 UBE2D1 的生产
使用 Twist Biosciences 合成了一个带有 N 端 8xHistidine 标记和 HRV 3C 切割位点的 UBE2D1(1-147)表达质粒。使用 Q5 Site Directed Mutagenesis Kit(New England Biolabs E0554S)和标准克隆技术产生了 C85S 和 C111S 突变体。将 HI-Control BL21(DE3) E. coli 细胞(Lucigen 60,435-1)转化为表达质粒,使用单个菌落开始在 LB 培养基中进行过夜培养,然后接种到含有 50 mM 磷酸氢二钠 pH 7.0 和 50 μg/mL 卡那霉素的 Terrific Broth 培养基中的 1 L 培养中。该培养在 37°C 下生长,直到 OD600 达到约 1.2,此时将温度降至 19°C,并立即加入 0.5 mM(最终浓度)IPTG。细胞在收获之前允许过夜生长,然后通过离心收获。将细胞沉淀在 IMAC_A 缓冲液(50 mM Tris pH 8.0,400 mM NaCl,1 mM TCEP,20 mM 咪唑)中重悬,并在 18,000 psi 的细胞均质器中进行三次通行后裂解。然后通过以 45,000 x g 离心 30 分钟澄清细胞裂解液。 经过澄清的裂解物通过预先用 IMAC_A 缓冲液平衡的 5 mL HisTrap Excel 柱(Cytiva)进行流动。加载后,用 IMAC_A 缓冲液洗涤树脂直到紫外吸收达到基线,然后用 IMAC_B 缓冲液(50 mM Tris pH 8.0,400 mM NaCl,1 mM TCEP,500 mM 咪唑唑)的线性梯度洗脱蛋白质。洗脱物经 HRV 3C 蛋白酶处理,直到通过 ESI-LC/MS 确定组氨酸标签的裂解完全。在蛋白质透析到 IMAC_A 缓冲液时,裂解继续进行,从而实现了使用预先用 IMAC_A 缓冲液平衡的 3 mL Ni-NTA 树脂进行批量进行反向 IMAC 纯化。收集流过液,浓缩,并使用预先用 SEC 缓冲液(25 mM HEPES pH 7.5,150 mM NaCl,1 mM TCEP)平衡的 Superdex 75 16/600 柱(Cytiva)进行凝胶排阻色谱。在包含体积内的分数通过 SDS-PAGE 分析,含有纯蛋白质的分数被混合并浓缩。该方案用于生产 UBE2D1 的野生型,C85S 和 C85S/C111S 变体,产量约为∼90 mg/L。
Labeling of recombinant UBE2D1 with EK-1-8 and EK-1-38 probes
使用 EK-1-8 和 EK-1-38 探针标记重组 UBE2D1
对于 UBE2D1 C85S 的体外标记,每个样品中的重组纯人类蛋白(每个样品 0.1 微克)在 25 微升 PBS 中分别与 DMSO 载体、EK-1-8 或 EK-1-38 在 37°C 处理 30 分钟。每个样品与 1 微升 30 μM 罗丹明-叠氮基(在 DMSO 中)(Click Chemistry Tools AZ109-5)、1 微升 50 mM TCEP(在水中)(Strem 15-7400)、3 微升 TBTA 配体(0.9 mg/mL 在 1:4 DMSO/t-BuOH 中)(Sigma 678,937)和 1 微升 50 mM 硫酸铜(II)(Sigma 451,657)在室温下孵育 1 小时。然后用 10 微升 4x 还原 Laemmli SDS 样品加载缓冲液(Alfa Aesar J60015)稀释,95°C 煮沸 5 分钟,并通过 SDS/PAGE 分离。探针标记的蛋白质通过使用 ChemiDoc MP(Bio-Rad)进行凝胶内罗丹明荧光分析。蛋白负载通过银染色进行评估。
Pulldown of UBE2D1 from HAP1 cells with EK-1-8 probe
HAP1 WT细胞在70%的密度下预先用DMSO或50μM EN450原位处理1小时,然后用DMSO或10μM EK-1-8原位处理3小时。细胞被收集,通过声波裂解,裂解液被标准化为每个样本6毫克/毫升。标准化后,每个裂解液样本中取出30μL用于Western印迹分析输入,每个裂解液样本中取出500μL,与5mM生物素吡啶基叠氮(在DMSO中)(Sigma Aldrich 900,912)的10μL,50mM TCEP(在水中)的10μL,TBTA配体(0.9mg/mL在1:4 DMSO/t-BuOH中)的30μL和50mM硫酸铜(II)的10μL在室温下孵育2小时。蛋白质被沉淀,用冷MeOH洗涤3次,重新溶解在200μL的1.2% SDS/PBS(w/v)中,98°C加热5分钟,离心去除任何不溶性成分。然后将每个重新溶解的样品转移到含有30μL高容量链霉亲和素树脂(ThermoFisher 20,357)的1.5mL Eppendorf低粘附管中,使最终SDS浓度为0.2%。样品在4°C的转动器上过夜与链霉亲和素珠一起孵育。第二天,样品升温至室温并用0.2% SDS 和进一步用 500 μL PBS 洗涤 3 次,然后用 500 μL 水洗涤 3 次,以去除未标记的蛋白质探针。对于免疫印迹分析,洗涤后的珠子在 30 μL PBS 中重悬,转移到 1.5 mL Eppendorf 低粘附管中,与 10 μL Laemmli 采样缓冲液(4 倍)结合,加热至 95°C 5 分钟,并通过免疫印迹分析寻找富集的 UBE2D1 与非富集的对照 Vinculin。
Western blotting 免疫印迹分析
抗体 NFKB p105/p52(Abcam ab323670)、SFT(Abcam ab176561)、UBE2D2(Origene TA806600)、UBE2D3(Abcam ab176568)、UBE2D4(Invitrogen MA5-27358)、UBE2M/UBC12(Abcam ab109507)、DYKDDDDK 标签(D6W5B)(Cell Signaling Technology Cat#14793S)、Vinculin(Bio-Rad Cat#MCA465S)、GAPDH(Proteintech Cat#60004-I-Ig)是商业获得的,并按制造商推荐的稀释度准备。蛋白质通过SDS/PAGE分离,并使用Trans-Blot Turbo转移系统(Bio-Rad)转移到硝酸纤维素膜上。膜用含Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS-T)溶液中的5% BSA在室温下阻断30分钟,用TBS-T洗涤,然后用5% BSA在TBS-T中稀释的初级抗体在4°C过夜探测。用TBS-T洗涤3次后,膜在黑暗中与从LI-COR商业获得的IR680或IR800结合的二级抗体在5% BSA中以1:10,000稀释度在室温下孵育1小时。用TBST再洗涤3次后,使用Odyssey Li-Cor荧光扫描仪可视化印迹。 使用 Re-Blot Plus 强抗体去除溶液(EMD Millipore)去除膜,当需要进行额外的一次性抗体孵育时。
IsoTOP-ABPP chemoproteomic profiling
IsoTOP-ABPP 化学蛋白质组学分析
IsoTOP-ABPP研究已按先前报道的方法进行。
IsoTOP-ABPP mass spectrometry analysis
IsoTOP-ABPP 质谱分析
数据以MS1和MS2文件的形式使用Raw Extractor v.1.9.9.2(斯克里普斯研究所)提取,并使用IP2 v.3-v.5(综合蛋白质组学应用公司)中的ProLuCID搜索方法针对Uniprot人类数据库进行搜索。
TMT-based quantitative proteomic profiling
基于TMT的定量蛋白质组学分析
HAP1 WT细胞分别用DMSO载体或EN450(50μM)处理24小时,制备上述所述的裂解物。简而言之,每个样品中的25-100μg蛋白质经还原、烷基化和胰蛋白酶消化过夜。然后,使用商业可用的TMTsixplex(ThermoFisher 90061)套件,按照制造商的方案对各个样品进行同位素标记。标记的样品(每个样品20μg)被结合,用SpeedVac干燥,用300μL 0.1% TFA在H2O中重悬,然后根据制造商的方案使用高pH反相肽分离套件(ThermoFisher 84868)进行分级。分级后用SpeedVac干燥,用50μL 0.1% FA在H2O中重悬,然后按照以下所述的方法进行LC-MS/MS分析。
使用先前描述的方法,使用 Thermo Eclipse 和 FAIMS LC-MS/MS 进行定量 TMT 基础蛋白质组学分析。
Knockdown studies 沉默研究
RNAi是使用从Dharmacon购买的siRNA进行的。HAP1细胞以每个6cm培养皿100,000个细胞的密度接种,并允许其在过夜后附着。细胞使用25 nM的非靶向(Dharmacon D-001810-10)、抗UBE2M(Dharmacon L-004348-00)或抗UBE2D1 siRNA(Dharmacon L-0093870-00)进行转染,每孔使用7.5 μL的转染试剂DharmaFECT 1(Dharmacon T-2001-02)。对于四重基因敲除研究,使用12.5 nM的抗UBE2D1、UBE2D2(Dharmacon L-010383-00)、UBE2D3(Dharmacon L-008478-00)和UBE2D4(Dharmacon L-009435-00)siRNA,每孔使用15 μL的DharmaFECT1。转染试剂加入到OPTIMEM(ThermoFisher 31985070)培养基中,并在室温下孵育5分钟。同时,siRNA加入到相同量的OPTIMEM中。将OPTIMEM中的转染试剂和siRNA溶液混合,并在室温下孵育30分钟。将这些混合溶液与完整的DMEM稀释,每孔提供2 mL,并更换培养基。细胞与转染试剂共孵育48小时,然后将培养基更换为含有DMSO或50 μM EN450的培养基,并再孵育24小时。 然后收集细胞,通过 Western blotting 分析蛋白质丰度。
Lentiviral overexpression of NFKB p105
NFKB p105 的慢病毒过表达
在单独的 15 mL 圆锥瓶中,将 1 μg 表达克隆 cDNA(Origene RC208384L3)或对照 cDNA(Origene PS100093)与包装质粒 MD2G(1 μg,Addgene 12259)和 PSPAX2(1 μg,Addgene 12260)混合在每个培养皿的 600 μL OPTIMEM 和 Lipofectamine 2000 转染试剂(Invitrogen 11668027)与相等体积的 OPTIMEM(1:30 v/v)孵育 5 分钟,然后将管子组合并在室温下孵育 40 分钟。 DNA-Lipofectamine 混合物用 8 mL DMEM 稀释并加入 40%密度的 HEK293T 细胞在 10 cm 培养皿中。第二天,将培养基更换为 6 mL 新鲜 DMEM,培养 24 小时。
Transient overexpression of NFKB p105 in HEK293T cells
转染前,HEK293T 细胞被接种到 96 孔板(每孔 35,000 个细胞/100μL)或 6 孔板中。Flag 标记的 NFKB 质粒(Origene RC208384)或 GFP 对照质粒(Ward 等人,2019 年)被稀释到 Opti-MEM 培养基中(每孔 0.2μg DNA 稀释到 25μL Opti-MEM 中)。Lipofectamine 2000(Invitrogen, 11668019)被稀释到 Opti-MEM I 培养基中(每孔 0.5μL Lipofectamine 2000 稀释到 25μL Opti-MEM I 中)。DNA 和稀释后的 Lipofectamine 2000 以 1:1 的比例混合后在室温下孵育 30 分钟。DNA-Lipofectamine 2000 混合物用 50μL 完整 FBS DMEM 稀释,然后全部 100μL 加入每个孔中。转染后 24 小时,小心地从每个孔中吸出培养基,加入含 DMSO 或化合物的新鲜培养基,然后进行增殖分析。简而言之,对于 6 孔板实验,每孔接种 400,000 个细胞,每孔 4μg DNA 和 10μL Lipofectamine 2000 被稀释到 250μL Opti-MEM 中,最终转染体积为每孔 2mL。细胞在 48 小时后通过 Western blot 分析进行分析。
In vitro pulldown of UBE2D1 with GST-tagged NFKB1
用带有 GST 标记的 NFKB1 进行 UBE2D1 的体外拉下实验
谷胱甘肽琼脂糖4B珠(每个样品1μL包装珠,Cytiva 17075605)用洗涤缓冲液(30mM Tris(pH 7.5),100nM NaCl,5mM MgCl2,2mM DTT,0.1mg/mL BSA,10%甘油,0.01% Triton X-)洗涤3次,每次洗涤后以2000 x g收集珠子,然后在室温下轻轻摇动悬浮在阻断缓冲液中(30mM Tris(pH 7.5),100nM NaCl,5mM MgCl2,2mM DTT,100mg/mL BSA,10%甘油,0.01% Triton X-)中1小时,然后再洗涤两次。 GST-NFKB p105(每μL珠子1pmol,Novus H00004790-P01)在100μL中与珠子一起在4°C下轻轻摇动孵育2小时,然后珠子被洗涤三次。将珠子悬浮在含有50nM UBE2D1(Boston Biochem Inc.,E2-616-100)的洗涤缓冲液中(每个样品45μL),然后分装到PCR管中。通过立即加入15μL Laemmli缓冲液制备输入对照。珠子用5μL载体(10% DMSO,0.25% CHAPS)或EN450(50μM)处理,最终体积为50μL,并在4°C下轻轻摇动孵育过夜。 珠子用洗涤缓冲液(50 μL)洗涤 4 次,再用 20 μL 1x Laemmli's in PBS 悬浮,95°C 煮沸 5 分钟,以 1000 x g 离心 5 分钟,然后通过免疫印迹分析。
In vitro ubiquitination assay
体外泛素化实验
UBE2D1(5.2 μL,25 μM,Boston Biochem. Inc.,E2-616-100)与 0.5 μL DMSO 溶剂或 EN450(最终浓度为 10 μM)在 37°C 孵育 30 分钟。随后,加入 UBE1(0.95 μL,1 μM,Boston Biochem. Inc.,E-305-025),然后加入 Cul4A/RBX/NEDD8(0.7 μL,5 μM,Boston Biochem. Inc.,E3-441-025),NFΚB p105(19.1 μL,0.91 μM,Novus Biologicals,H00004790-Q01),FLAG-泛素(0.5 μL,10 mg/mL,Boston Biochem. Inc.,U12001M),MgCl2(0.5 μL,500 mM),DTT(0.5 μL,500 mM)和 ATP(0.5 μL,100 mM)以达到最终体积 25.5 μL。将混合物在 37°C 下搅拌孵育 4 小时。然后加入 10 μL Laemmli SDS 样品加载缓冲液以停止反应,并通过免疫印迹分析蛋白质。所有稀释均使用 50 mM TBS(pH 7.5)进行。
Synthetic methods and characterization for EN450 and EK-1-8
EN450 和 EK-1-8 的合成方法和表征
Preparation of N-(2-chloro-5-(N,N-dimethylsulfamoyl)phenyl)acrylamide
制备 N-(2-氯-5-(N,N-二甲基磺酰)苯基)丙烯酰胺
将二甲胺(0.198 毫升,2.35 毫摩尔)溶解在 DCM(5 毫升)中,滴加三乙胺(0.326 毫升,2.35 毫摩尔)。在 0 摄氏度搅拌 45 分钟。然后,将 3-硝基-4-氯苯磺酰氯(500 毫克,1.95 毫摩尔)溶解在 2:1 DCM/THF(5 毫升)中滴加,反应混合物升温至室温 5 分钟,反应混合物用 DCM 稀释,用水、食盐水洗涤,经过 NaSO4 干燥,过滤,滤液在减压下浓缩。残渣经硅胶快速色谱纯化(0-30% EtOAc/Hexanes)得到所需产物 4-氯-N,N-二甲基-3-硝基苯磺酰胺(464 毫克,90%)为淡黄色固体。LCMS。H NMR(400 兆赫,CDCl)δ 8.27(t,J = 2.2 赫兹,1H),7.93(dd,J = 8.4,2.1 赫兹,1H),7.78(d,J = 8.4 赫兹,1H),2.81(d,J = 1.7 赫兹,6H)。LCMS Rt 0.066 分钟;m/z 264.8 [M + H]。
将氯化铵(346毫克,6.46毫摩尔)溶解在1:1的乙醇/水(10毫升)溶液中,加入铁粉(362毫克,6.46毫摩尔)。将溶液在60°C搅拌30分钟。然后加入4-氯-N,N-二甲基-3-硝基苯磺酰胺(286毫克,1.08毫摩尔)。将溶液在80°C搅拌1小时,然后用二氯甲烷稀释,用水、食盐水洗涤,经过硫酸钠干燥,过滤,浓缩产物得到3-氨基-4-氯-N,N-二甲基苯磺酰胺(183毫克,78%)为白色粉末。LCMS Rt 0.085分钟;m/z 259.1 [M + H]。
将 3-氨基-4-氯-N,N-二甲基苯磺酰胺(100 毫克,0.37 毫摩尔)溶解于 DCM(15 毫升)中,滴加三乙胺(80 微升,0.57 毫摩尔)。将溶液在 0 摄氏度搅拌 5 分钟。加入丙烯酰氯(67 微升,0.83 毫摩尔),并将溶液加热至室温。2 小时后,将混合物稀释至水,用 DCM 萃取,用卤水洗涤,过硫酸钠干燥,过滤,将滤液浓缩至干燥。残渣经硅胶快速色谱纯化(20-50%乙酸乙酯/己烷)得到 N-(2-氯-5-(N,N-二甲基磺酰基)苯基)丙烯酰胺(毫克,%)为白色粉末。H NMR(500 兆赫,CDCl)δ8.91(d,J = 2.1 赫兹,1H),7.85(s,1H),7.58(d,J = 8.4 赫兹,1H),7.52(dd,J = 8.4,2.1 赫兹,1H),6.52(dd,J = 16.8,1.0 赫兹,1H),6.35(dd,J = 16.8,10.2 赫兹,1H),5.91(dd,J = 10.2,1.0 赫兹,1H),2.80(s,6H)。
C NMR(126 兆赫,CDCl)δ162.72,134.80,134.41,129.77,128.82,128.75,126.37,123.05,119.90,37.33。
HRMS 计算得到 C11H13ClN2O3S(M + H)+ 289.04137,实验值 289.04050。
Preparation of N-(2-chloro-5-(N,N-dimethylsulfamoyl)phenyl)propionamide
N-(2-氯-5-(N,N-二甲基磺酰基)苯基)丙酰胺的制备
将 3-氨基-4-氯-N,N-二甲基苯磺酰胺(60 毫克,0.26 毫摩尔)溶解于 DCM(5 毫升)中,滴加三乙胺(54 微升,0.38 毫摩尔)。将溶液在 0 摄氏度搅拌 5 分钟。加入丙酰氯(25 微升,0.28 毫摩尔),并将溶液加热至室温。10 分钟后,将混合物稀释水,用 DCM 萃取,用盐水洗涤,经过 NaSO4 干燥,过滤,将滤液在真空中浓缩。残渣经硅胶快速色谱纯化(30-60% 乙酸乙酯/己烷),得到 N-(2-氯-5-(N,N-二甲基磺酰基)苯基)丙烯酰胺(48 毫克,65%)为白色粉末。
1 H NMR(500 兆赫,CDCl3)δ 8.79(d,J = 2.3 赫兹,1H),7.75(s,1H),7.54(d,J = 8.4 赫兹,1H),7.47(dd,J = 8.4,2.2 赫兹,1H),2.77(s,6H),2.52(q,J = 7.5 赫兹,2H),1.29(t,J = 7.5 赫兹,3H)。
13 C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 172.52,135.58,129.82,127.37,123.74,120.99,38.37,31.19,9.66。
HRMS 计算得到的 C11H15ClN2O3S(M + H)+ 291.05702,实验测得 291.05624。
Preparation of N-(2-chloro-5-(N-methyl-N-(prop-2-yn-1-yl)sulfamoyl)phenyl)acrylamide
将 N-甲基丙炔胺(0.198 mL,2.35 mmol)溶解于 DCM(5 mL)中,滴加三乙胺(0.326 mL,2.35 mmol)。在 0 摄氏度搅拌 45 分钟。然后,将 3-硝基-4-氯苯磺酰氯(500 mg,1.95 mmol)溶解于 2:1 DCM/THF(5 mL)中,滴加到溶液中,加热至室温 5 分钟,反应混合物用 DCM 稀释,用水、食盐水洗涤,经过 NaSO4 干燥,过滤,滤液在减压下浓缩。残渣经硅胶快速色谱纯化(0-30% EtOAc/Hexanes)得到目标产物 4-氯-N-甲基-3-硝基-N-(丙-2-炔-1-基)苯磺酰胺(311 mg,55%)为淡黄色固体。LCMS。m/z 288.1 [M + H] 1 H NMR(500 MHz,CDCl 3 )δ 8.36(d,J = 2.2 Hz,1H),7.99(dd,J = 8.4,2.2 Hz,1H),7.75(d,J = 8.5 Hz,1H),4.17(d,J = 2.6 Hz,2H),2.92(s,3H),2.26–2.11(m,1H)。LCMS Rt 0.066 分钟;m/z 288.2 [M + H]。
将氯化铵(350毫克,6.46毫摩尔)溶解于1:1乙醇/水(10毫升)中,加入铁粉(360毫克,6.46毫摩尔)。将溶液在60°C搅拌30分钟。然后加入4-氯-N-甲基-3-硝基-N-(丙-2-炔-1-基)苯磺酰胺(311毫克,1.08毫摩尔)。将溶液在80°C搅拌1小时,然后用二氯甲烷稀释,用水、食盐水洗涤,经过硫酸钠干燥,过滤,浓缩滤液得到3-氨基-4-氯-N-甲基-N-(丙-2-炔-1-基)苯磺酰胺(201毫克,72%)为白色粉末。H NMR(500 MHz,CDCl)δ 7.29(s,1H),7.15(d,J = 2.2 Hz,1H),7.01(dd,J = 8.3,2.2 Hz,1H),4.47–4.10(m,2H),3.94(d,J = 2.6 Hz,2H),2.76(s,3H),2.11–2.06(m,1H)。LCMS Rt 0.075 min;m/z 259.1 [M + H]。
将 3-氨基-4-氯-N-甲基-N-(丙-2-炔-1-基)苯磺酰胺(100 毫克,0.37 毫摩尔)溶解于 DCM(15 毫升)中,滴加三乙胺(70 微升,0.50 毫摩尔)。将溶液在 0 摄氏度搅拌 5 分钟。加入丙烯酰氯(67 微升,0.83 毫摩尔),并将溶液加热至室温。2 小时后,将混合物稀释至水,用 DCM 萃取,用盐水洗涤,过硫酸钠干燥,过滤,将滤液在真空中浓缩。残渣经硅胶快速色谱纯化(20-50%乙酸乙酯/己烷)得到 N-(2-氯-5-(N-甲基-N-(丙-2-炔-1-基)磺酰基)苯基)丙烯酰胺(116 毫克,97%)为白色粉末。H NMR(500 兆赫,CDCl)δ 8.94(s,1H),7.82(s,1H),7.53(d,J = 1.3 赫兹,2H),6.49(dd,J = 16.9,1.1 赫兹,1H),6.32(dd,J = 16.9,10.3 赫兹,1H),5.88(dd,J = 10.2,1.1 赫兹,1H),4.04(d,J = 2.5 赫兹,2H),2.90(s,3H),2.10(q,J = 3.1 赫兹,1H)。
C NMR(126 兆赫,CDCl)δ 163.24,136.82,134.96,130.37,129.35,129.28,127.09,123.68,120.58,75.90,74.11,39.75,34.44。
HRMS 计算为 C13H13ClN2O3S(M + H)+ 313.04137,实测为 313.04053。
Preparation of N-(2-chloro-5-(N-methyl-N-(prop-2-yn-1-yl)sulfamoyl)phenyl)propionamide
N-(2-氯-5-(N-甲基-N-(丙-2-炔-1-基)磺酰基)苯基)丙酰胺的制备
将 3-氨基-4-氯-N-甲基-N-(丙-2-炔-1-基)苯磺酰胺(50 毫克,0.19 毫摩尔)溶解于 DCM(2 毫升)中,滴加三乙胺(78 微升,0.56 毫摩尔)。将溶液在 0 摄氏度搅拌 5 分钟。加入丙酰氯(50 微升,0.56 毫摩尔),并将溶液加热至室温。10 分钟后,将混合物稀释水,用 DCM 萃取,用盐水洗涤,经过 NaSO4 干燥,过滤,将滤液浓缩至干燥。残渣经硅胶快速色谱纯化(30-60%乙酸乙酯/己烷)得到 N-(2-氯-5-(N-甲基-N-(丙-2-炔-1-基)磺酰基)苯基)丙酰胺(35 毫克,58%)为白色粉末。
1 H NMR(500 兆赫,CDCl3)δ 8.87(s,1H),7.73(s,1H),7.52(d,J = 1.3 赫兹,2H),4.05(d,J = 2.5 赫兹,2H),2.91(s,3H),2.52(q,J = 7.5 赫兹,2H),2.12(d,J = 2.5 赫兹,1H),1.30(t,J = 7.5 赫兹,3H)。
Quantification and statistical analysis
定量和统计分析
统计细节可以在图例和补充表中找到。基于 TMT 的定量蛋白质组学的统计分析如下进行。高置信度的蛋白质鉴定报告使用<1%的假阳性发现率(FDR)截断。差异丰度显著性是使用 ANOVA 与 Benjamini-Hochberg 校正来确定 p 值进行估计。IsoTOP-ABPP 数据分析如下进行。轻重同位素探针修饰的肽比率是通过计算每个重复配对的轻重前体丰度的比率的平均值来计算的,所有与一个肽相关的肽-光谱匹配。这些配对的丰度还用于计算配对样本 t 检验 p 值,以估计配对丰度的恒定性和治疗与对照之间的变化的显著性。p 值使用 Benjamini-Hochberg 方法进行校正。所有其他统计分析均通过学生的双尾 t 检验进行。
Data and code availability
数据和代码可用性
- •All proteomic raw data files are available via ProteomeXchange with Project accession PXD039924. The mass spectrometry proteomics data have been deposited to the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE partner repository with the database identifier PXD039924.
所有蛋白质组学原始数据文件均可通过 ProteomeXchange 获得,项目访问号为 PXD039924。质谱蛋白质组学数据已通过 PRIDE 合作伙伴库存储到 ProteomeXchange 联盟中,数据库标识符为 PXD039924。 - •Data processing and statistical analysis algorithms for chemoproteomics from our lab can be found on our lab’s Github site: https://github.com/NomuraRG, and we can make any further code from this study available upon request.
我们实验室的化学蛋白质组学数据处理和统计分析算法可在我们实验室的 Github 网站上找到:https://github.com/NomuraRG,我们可以根据请求提供本研究的任何进一步代码。 - •Any additional information required to reanalyze the data reported in this paper is available from the lead contact upon request.
本文报告的数据重新分析所需的任何额外信息可根据请求从主要联系人处获得。
Acknowledgments 致谢
我们感谢野村研究小组和诺华生物医学研究所的成员对手稿的重要阅读。本工作得到了诺华生物医学研究所和诺华-伯克利蛋白质组学和化学技术中心(NB-CPACT)对所有列出作者的支持。此工作还得到了野村研究小组和马克癌症研究基金会颁发给 D.K.N.、E.A.K. 的 ASPIRE 奖的支持。此工作还得到了国家科学基金会分子生物技术奖(2127788)(D.K.N.)和国家科学基金会研究生研究奖学金(E.A.K.)的资助。我们还感谢 Hasan Celik 博士、Alicia Lund 博士和加州大学伯克利分校化学学院的核磁共振设施(CoC-NMR)提供的光谱学帮助。CoC-NMR 中的仪器部分得到了 NIH S10OD024998 的支持。
Author contributions 作者贡献
E.A.K.和 D.K.N.构思了项目的想法,设计了实验,执行了实验,分析和解释了数据,并撰写了论文。E.A.K.,Y.C.,N.S.H.,D.D.和 D.K.N.执行了实验,分析和解释了数据,并提供了智力贡献。E.A.K.,D.D.,J.A.T.,J.M.K.和 M.S.为项目和项目整体设计提供了智力贡献。
Declaration of interests 利益声明
J.A.T.,J.M.K.和 D.D.是 Novartis 生物医学研究所的雇员。本研究由 Novartis 生物医学研究所和 Novartis-Berkeley 转化化学生物学研究所资助。D.K.N.是 Frontier Medicines 和 Vicinitas Therapeutics 的联合创始人,股东,并担任科学顾问委员会成员;Vicinitas Therapeutics 董事会成员;The Mark Foundation for Cancer Research,Photys Therapeutics,Apertor Pharmaceuticals,Ecto Therapeutics,Oerth Bio 和 Chordia Therapeutics 科学顾问委员会成员;以及 Droia Ventures 投资顾问委员会成员。
Supplemental information 补充信息
- Document S1. Figures S1–S3
文档 S1. 图表 S1–S3
- Table S1. Structures of covalent ligands screened in this study, related to Figure 1
表格 S1. 本研究中筛选的共价配体结构,与图 1 相关
- Table S2. Cysteine chemoproteomic profiling of EN450 targets in HAP1 cells using isoTOP-ABPP, related to Figure 2
表格 S2. 使用 isoTOP-ABPP 在 HAP1 细胞中对 EN450 靶点进行半胱氨酸化学蛋白质组学分析,与图 2 相关HAP1 cells were treated with DMSO vehicle or EN450 (50 μM) for 3 h, after which resulting cell lysates were labeled with an alkyne-functionalized iodoacetamide cysteine-reactive probe (200 μM) for 1 h, and an isotopically light (for DMSO) or heavy (for EN450) biotin-azide handle bearing a TEV protease recognition peptide was appended by CuAAC. Control and treated proteomes were combined in a 1:1 ratio, taken through the isoTOP-ABPP procedure and light/heavy probe-modified peptides were analyzed by LC-MS/MS and quantified
HAP1 细胞分别用 DMSO 载体或 EN450(50 μM)处理 3 小时,随后将得到的细胞裂解物用烷基化碘乙酰胺半胱氨酸反应探针(200 μM)标记 1 小时,然后通过 CuAAC 附加一个同位素轻(对于 DMSO)或重(对于 EN450)生物素-偶氮手柄,带有 TEV 蛋白酶识别肽。对照组和处理组的蛋白质组以 1:1 比例混合,经过 isoTOP-ABPP 程序处理,轻/重探针修饰的肽段通过 LC-MS/MS 分析并定量
- Table S3. TMT-based quantitative proteomic profiling of EN450 in HAP1 cells, related to Figure 3
表S3. TMT基于定量蛋白质组学分析EN450在HAP1细胞中的相关性,参见图3。HAP1 cells were treated with DMSO vehicle or EN450 (50 μM) for 24 h. Data shown are from n = 3 biologically independent replicates/group
HAP1细胞分别用DMSO载体或EN450(50μM)处理24小时。所示数据来自n = 3个生物独立重复/组。
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- Graphical Abstract
- Figure 1Discovery of a covalent molecular glue degrader with anti-proliferative activities in HAP1 leukemia cancer cells
- Figure 2Chemoproteomic profiling and validation of EN450 targets in HAP1 cells
- Figure 3Identification of the protein degraded by EN450
- Figure 4Understanding the role of NFKB1 in EN450-mediated effects